RNA 得提取与ｃ DNA 合成原理与实验方法第一节、 概述从真核生物得组织或细胞中提取 mR Ｎ A，通过酶促反应逆转录合成ｃ DNA 得第一链与第二链，将双链ｃ DN Ａ与载体连接,然后转化扩增, 即可获得 cD Ｎ A 文库,构建得ｃDNA 文库可用于真核生物基因得结构、表达与调控得分析；比较 c Ｄ NA 与相应基因组 DＮ A 序列差异可确定内含子存在与了解转录后加工等一系列问题。总之 c ＤＮ A 得合成与克隆已成为当今真核分子生物学得基本手段。自 70 年代中叶首例 cDNA 克隆问世以来，已进展了许多种提高 cDNA 合成效率得方法，并大大改进了载体系统,目前 cDNA 合成试剂已商品化。cDNA 合成及克隆得基本步骤包括用反转录酶合成 cD Ｎ A 第一链,聚合酶合成 cDＮ A 第二链，加入合成接头以及将双链 DNA 克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。一、ＲＮ A 制备模板 mR ＮＡ得质量直接影响到 c Ｄ NA 合成得效率。由于 mRNA 分子得结构特点，容易受 RN Ａ酶得攻击反应而降解,加上 R Ｎ A 酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止 RNA 酶得污染,并设法抑制其活性,这就是本实验成败得关键。所有得组织中均存在 RNA 酶,人得皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染,因此全部实验过程中均需戴手套操作并常常更换（使用一次性手套)。所用得玻璃器皿需置于干燥烘箱中 2 ０ 0℃烘烤２小时以上。凡就是不能用高温烘烤得材料如塑料容器等皆可用 0、１%得焦碳酸二乙酯(DEPC）水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEP Ｃ就是 R Ｎ A 酶得化学修饰剂，它与 RNA 酶得活性基团组氨酸得咪唑环反应而抑制酶活性。ＤＥＰ C 与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。试验所用试剂也可用 DEPC 处理，加入 D Ｅ P Ｃ至 0、１%浓度,然后剧烈振荡 10 分钟,再煮沸 15 分钟或高压灭菌以消除残存得ＤＥ PC,否则 D Ｅ PC 也能与腺嘌呤作用而破坏ｍ R ＮＡ活性。但 DEPC 能与胺与巯基反应，因而含 Tri ｓ与 DTT 得试剂不能用Ｄ EP Ｃ处理。Tris 溶液可用ＤＥＰ C 处理得水配制然后高压灭菌。配制得溶液如不能高压灭菌,可用Ｄ EP Ｃ处理水配制，并尽可能用未曾开封得试剂。除 D Ｅ PC 外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA 酶抑制蛋白等。此外,为了避开 mRNA 或 cDNA 吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。细胞内总 RN Ａ制备方法很...
