纤维素酶活的测定

纤维素酶活的测定一 纤维素酶活力单位定义在 37℃、pH 值为 5.50 的条件下，每分钟从浓度为 4mg/ml 的羧甲基纤维素钠溶液中降解 1umol 还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位 U。二 测定原理 纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原集团的单糖在沸水浴条件下可以与 DNS 试剂发生显色反应，反应颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中的纤维素酶的活力。三 试剂与溶液除特别说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合 GB/T6682 中规定的三级水。3.1 葡萄糖溶液，c（C6H12O6）=10.0mg/ml称取无水葡萄糖 1.000g，加水溶解，定容至 100ml。3.2 乙酸溶液，c(CH3COOH)=0.1mol/L吸取冰乙酸 0.60ml，加水溶解，定容至 100ml。3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）=0.1 mol/L 称取三水乙酸钠 1.36g，加水溶解，定容至 100ml。3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）=200g/L称取氢氧化钠 20.0g，加水溶解，定容至 100ml。3.5 乙酸-乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH-CH3COONa）称取三水乙酸钠 11.57g，加入冰醋酸 0.85ml，加水溶解，定容至 1000ml，测定溶液的 pH 值，假如 pH 偏离 5.50，用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调至 5.50.3.6 羧甲基纤维素钠溶液，0.8%（w/v）称取羧甲基纤维素钠（Sigma C5678）0.40g，加入到盛有 30ml3.5 缓冲溶液的烧杯中，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至羧甲基纤维素钠完全溶解（在搅拌加热过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过 50ml），停止搅拌，用 3.5 缓溶将其定容至 50ml，羧甲基纤维素钠溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4℃避光保存，有效期为 3 天。3.7 DNS 试剂称取 3，5-二硝基水杨酸（化学纯）3.15g，加水 500ml，搅拌 5min，水浴至 45℃，然后逐步加入 100ml氢氧化钠溶液（3.4），同时不断搅拌，知道溶液清亮透明（在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）.再逐步加入四水酒石酸钾钠 91.0g、苯酚 2.50g 和无水亚硫酸钠 2.50g，继续 45℃水浴加热，同时补加水 300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解，停止加热，冷却至室温后，用水定容至 1000ml，用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色试剂瓶中，避光保存，室温下可以存放 7 天后可以使用，有效期为 6 个月。四 仪器与设备4.1...