质粒Ｄ NA 得提取、定量、酶切与ＰＣＲ鉴定一、实验目得１、学习并掌握用碱裂解法提取质粒Ｄ NA 得方法;2、学习并掌握了解质粒酶切鉴定得方法;３、学习并掌握紫外吸收检测 DNA 浓度与纯度得原理与方法;4、学习并掌握 P Ｃ R 基因扩增得实验原理与操作方法；5、学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳得原理与使用方法.二、实验原理1、PCR（多聚酶链式反应) 在 DNA 聚合酶催化下，可以 DNA 为模板,以特定引物为延伸起点,以ｄ NT Ｐ为原料,通过变性、退火、延伸等步骤, 在体外(缓冲液中）复制 D Ｎ A,使目得 DNA 按２ｎ方式呈指数形式扩增。 P Ｃ R 一次循环得具体反应步骤为：A、变性：加热反应系统至 9 ５℃，使模板 DNA 在高温下完全变性，双链解链 。 Ｂ、退火:逐渐降低溶液温度,使合成引物在低温（3 ５—70℃，一般低于模板 Tm 值得５℃左右）,与模板 DNA 互补退火形成部分双链. C、延伸：溶液反应温度升至中温 72℃，在 Ｔ aq 酶作用下，以 dN Ｔ P 为原料,引物为复制起点，模板 D Ｎ A 得一条单链在解链与退火之后延伸为一条双链。 2、质粒 DN Ａ得提取与制备(1)、碱裂解法：染色体 DN Ａ与质粒 DN Ａ得变性与复性存在差异:A、高碱性条件下，染色体 DNA 与质粒 DNA 均变性;B、当以高盐缓冲液调节其 pH 值至中性时，变性得质粒 DN Ａ复性并保存在溶液中,染色体Ｄ NA 不能复性而形成缠连得网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。（２）、离心层析柱：Ａ、硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下可选择性地结合溶液中得质粒Ｄ NA，而不吸附溶液中得蛋白质与多糖等物质；B、通过去蛋白液与漂洗液将杂质与其它细菌成分去除;ﻭC、低盐，高ｐ H 值得洗脱缓冲液将纯净质粒Ｄ N Ａ从硅基质膜上洗脱.3.质粒 D Ｎ A 得定量分析（紫外分光光度法):A、物质在光得照射下会产生对光得吸收效应，且其对光得吸收就是具有选择性；B、各种不同得物质都具有其各自得吸收光谱：DNA 分对波长 260nm 得紫外光有特异得吸收峰蛋白质对波长２ 80nm 得紫外光有特异得吸收峰碳水化合物对 23 ０ｎ m 得紫外光有特异得吸收峰C、A260/A2 ８ 0 及Ａ２６ 0／A23 ０得比值可以反应 DNA 得纯度;A2 ６ 0／Ａ２８ 0＝1、８ D ＮＡ纯净A ２６０/A ２ 80＜1、8 表示样品中含蛋白质(芳香族)或酚类物质A26 ０/A280〉1、8 含 RNA 杂质,用 R Ｎ A 酶去除。4.质粒Ｄ NA 得酶切鉴定:限...
