IL-1RaIL-1β试纸条检测方法建立及其在布鲁氏菌病感染与免疫鉴别诊断中的应用探讨

IL-1Ra/IL-1β 试纸条检测方法建立及其在布鲁氏菌病感染与免疫鉴别诊断中的应用探讨白细胞介素简称白介素(Interleukin,IL),是一类多由白细胞产生的细胞因子的总称。其中,白介素-1 家族(Interleukin-1 family,IL-1F)参加机体免疫过程并在炎症反应中起重要作用。白介素 1β(IL-1β)和其受体拮抗因子(IL-1Ra)是 IL-1F 中最重要的成员。炎症反应过程中,IL-1β 表达量增多,促进炎症进程;IL-1Ra 常与其呈拮抗趋势,抑制 IL-1β 生物学功能。IL-1Ra 与 IL-1β 间的拮抗作用引起其比值(IL-1Ra/IL-1β)在许多疾病的诊断、治疗等过程中具有重要指示意义,例如骨关节炎、布鲁氏菌病等。布鲁氏菌病(简称布病)是危害严重的人兽共患流行病。由于目前没有可靠的区别布病感染与免疫鉴别诊断方法,大量布病免疫动物因检测血清布病抗体反应阳性而被当作布病患病动物扑杀,带来巨大经济损失。本课题组前期发现,IL-1β 和 IL-1Ra 的表达量在布病中呈现明显变化,进一步讨论表明,IL-1Ra/IL-1β 比值在布病自然感染动物与人工免疫动物中差异显著,因此提出,IL-1Ra/IL-1β 可能对区别布病感染与免疫鉴别诊断具有重要指示意义。基于前期讨论成果,本课题旨在建立 IL-1Ra/IL-1β 的双 T 线胶体金免疫层析试纸条检测方法,并将该检测方法初步应用于布病鉴别诊断,探求 IL-1Ra/IL-1β 的疾病诊断价值。实验以高纯度 IL-1β 与 IL-1Ra 全长重组蛋白作为标准品,以 IL-1β、IL-1Ra 的多物种保守区重组蛋白 IL-1β-1、IL-1Ra-1、IL-1β-1Ra-2 作为免疫原,成功制备了抗 IL-1β-1 的豚鼠源多抗、抗 IL-1Ra-1 的豚鼠源多抗和抗 IL-1β-1Ra-2 的兔源多抗。制备颗粒大小为 20 nm 的胶体金溶液,优化偶联条件后,成功得到与抗 IL-1β-1Ra-2 兔源多抗成功偶联的胶体金探针。采纳 sartorius140 NC 膜成功组装IL-1Ra/IL-1β 双 T 线胶体金免疫层析试纸条,T1 线(抗 IL-1β-1 抗体)工作浓度为 2 mg/mL,T2 线(抗 IL-1Ra-1 抗体)工作浓度为 1 mg/mL;C 线(羊抗兔抗体)工作浓度为 0.8 mg/mL。试纸条工作流程为:血清样品与胶体金探针预混并充分结合后,14000 rpm离心 20 min,弃上清并用 100μL 上样缓冲液重悬沉淀,重悬液滴加在试纸条样品垫,待试纸条干透,拍照并用 ImageJ 软件分析处理结果。最终确定 IL-1β 的标准曲线方程为 y=24701x+9679.9,R~2 为 0.9726,检测限为 0.7 ng/mL;IL-1Ra 的标准曲线方程为 y=35117x+3247.9,R~2...