PD-1通路在BVDV抑制牛外周血T淋巴细胞增殖、诱导凋亡中的作用及其机制

PD-1 通路在 BVDV 抑制牛外周血 T 淋巴细胞增殖、诱导凋亡中的作用及其机制牛病毒性腹泻-粘膜病(BVD-MD)是在世界范围内对养牛业造成巨大经济损失的重要传染病,也是规模化养牛场和国际贸易中重点检疫的牛传染病。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)急性感染可导致牛外周血淋巴细胞(PBL)减少、凋亡和免疫抑制。在慢性病毒感染过程中 PD-1 信号通路可以介导协同抑制信号,抑制 T 淋巴细胞的活化、增殖,诱导凋亡。然而,在急性病毒感染中 PD-1 通路对 T 细胞的调控作用并不明确。尤其是在 BVDV 急性感染中 PD-1 通路是否参加调控了 PBL 的减少和凋亡,促进免疫抑制的形成,尚不明确。为了确定 PD-1 通路是否与 BVDV 急性感染导致的牛 PBL 减少和凋亡具有相关性。首先,采纳梯度密度水平离心法从 BVDV 急性感染牛颈静脉抗凝血中分离外周血单个核细胞(PBMC),再通过免疫微珠法从 PBMC 中分选出 PBL 和 CD14~+外周血单核细胞(PBM),qRT-PCR 和 Western blot 检测两种细胞亚群的 PD-1 和 PD-L1表达水平,流式细胞术检测 PBL 凋亡,CCK-8 法检测 PBL 增殖。其次,选择 CP 型BVDV-1 NADL 株和 NCP 型 BVDV-1KD 株分别体外感染健康牛 PBMC,再分选出 PBL 和CD14~+PBM,检测 PD-1 和 PD-L1 表达水平,以及 PBL 增殖和凋亡情况。结果表明,与健康牛相比,BVDV 急性感染牛 PBL 的 PD-1 mRNA(p<0.001)和蛋白表达水平(p<0.01)显著上调,CD14~+PBM 的 PD-L1mRNA(p<0.01)和蛋白表达(p<0.01)显著上调,同时 PBL 的凋亡显著增加(p<0.001),增殖显著减少。其次,CP 和 NCP 型 BVDV 体外感染均可诱导 PD-1 和 PD-L1 mRNA 和蛋白表达的显著上调,随着感染时间的延长 PD-1 和 PD-L1 mRNA 的表达水平逐渐升高,PD-1 和 PD-L1 的表达上调伴随着 PBL 凋亡显著增加(p<0.05)和增殖的显著减少。为了确定阻断 PD-1 通路对 PBL 凋亡和增殖的影响。选择 CP 型 BVDV-1 NADL株和 NCP 型 BVDV-1 KD 株分别体外感染健康牛 PBMC,采纳单抗阻断 PD-1 通路,再通过流式细胞术检测 PBL 凋亡,CCK-8 法检测 PBL 增殖,ELISA 检测细胞因子分泌,以及 qRT-PCR 检测病毒载量。结果表明,阻断 PD-1 通路可以显著减少 BVDV 体外感染导致的 PBL 凋亡(p<0.05),恢复了 PBL 的增殖(CP 型 BVDV,p<0.05),降低了病毒载量(p<0.05),增加了 IFN-γ(CP 型 BVDV,p<0.01)和 IL-2(p<0.05)分泌水平。为了确定 BVDV ...