乳鼠肾细胞的原代培养

乳鼠肾细胞的原代培育生 72 伍国羽 2025012357实验日期：2025 年 11 月 27 日 星期五1. 实验目的1) 掌握原代细胞培育的原理与操作方法，了解无菌操作的条件和注意事项；2) 了解并通过实践学习处死与解剖乳鼠和识别、取出乳鼠肾脏的方法；3) 学习细胞原代培育和传代培育的方法。2. 实验原理新生约 3 天的乳鼠体内的组织与器官均没有发育成熟，处于旺盛的分裂生长时期，因此是用作细胞培育的良好材料，适当的培育就可以观察到贴壁和分裂增殖现象。由于肾脏的细胞类型较为单一并且肾脏本身易于从乳鼠体内取出，将肾作为实验材料是较好的选择。在进行细胞培育之前，首先要从组织中提取出大量的分散的单细胞并制备成细胞悬液。这就需要首先破坏细胞外基质以及细胞连接对组织细胞的“束缚”。胚胎或新生动物的组织中细胞外基质和细胞连接并没有充分形成，这也是将新生动物作为实验材料的原因之一。原代培育也称初代培育，严格的说即从体内取出组织接种培育到第一次传代阶段，但实际上，通常把第一代至第十代以内的培育细胞统称为原代细胞培育。一般持续 1 一 4 周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培育细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。最常用的原代培育有组织块培育和分散细胞培育。组织块培育是将剪碎的组织块直接移植在培育瓶壁上，加入培育基后进行培育。分散细胞培育则是将组织块用机械法或化学法使细胞分散。如欲从胎儿或新生儿的组织分离到活性最好的游离细胞，经典的方法是用蛋白水解酶（如胰蛋白酶和胶原酶）消化细胞间的结合物，或用金属离子螯合剂（如 EDTA）除去细胞互相粘着所依赖的 Ca2+，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。本实验中使用的是分散细胞培育。 3. 实验用品实验材料：超净工作台、倒置显微镜、二氧化碳培育箱、水浴锅、高压灭菌锅、离心机、滤器、酒精灯、酒精棉、镊子、器械缸、废液缸、记号笔，蜡盘、大头针、眼科剪、眼科镊，移液器架、移液器、吸头，试剂瓶、试剂瓶架，平皿、细胞培育瓶、离心管等 实验试剂：PBS 溶液、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 溶液、DMEM 培育基 4. 实验步骤1) 将乳鼠（3 天左右）断头放血致死。2) 进入无菌间，用 70%乙醇消毒乳鼠体表，将其固定在蜡盘上。3) 在超净台内，将其背部皮肤剪出一个“工”字型开口，然后将皮肤拉开，固定在蜡盘上，使其腰背部肌肉暴露出来。4) 用 70%乙醇消毒背部肌肉，在脊柱两侧各剪一切口，...