泛素化蛋白质组

一、叶片总蛋白的提取消化1、取 2 g 叶片，在研钵中加入液氮充分研磨，然后转到离心管中，加入 30 ml 预冷的含有10% TCA 和 0.07% DTT 的丙酮，充分混匀后在-20°C 沉淀过夜。2、4°C，35000 g 离心 1 h 后，弃上清。加入 30 ml 预冷的含有 0.07% DTT 的丙酮，充分混匀后置于-20°C 中 1h。4°C，35000 g 离心 1 h，弃上清。3、用 30 ml 预冷的含有 0.07% DTT 的丙酮洗涤沉淀 2 次，最后打开管盖风干，尽量使残留的丙酮挥发洁净。4、取适量裂解液(20Mm HEPES pH8.0，8M Urea，2.5mM 焦磷酸钠，1mMβ-甘油磷酸盐，50uM PR-169)溶解蛋白粉末。5、25000 g，4°C 离心 30 min 后，收集上清，即为蛋白，如上清含有杂质可再离心一次，定量测定蛋白含量后置于-80°C 或进行下一步操作。本实验采纳考马斯亮蓝法(Bradford 法)测定蛋白质浓度，用 BSA 作为标准液，在 96 孔板中加入相应的 BSA 标准蛋白以及考马斯亮蓝试剂。BSA 浓度（ul）0.20.40.60.81.01.21.41.62.02.43.0100 μg/ml 标准蛋白(μl)0.81.62.43.244.85.66.48.09.612H2O(μl)39.238.437.636.836.035.234.433.632.030.428.0按顺序将上述标准蛋白加入 96 孔板，同时，将 5μl 待测蛋白液，95 μl 的考马斯亮蓝试剂混匀后加入 96 孔板，三次重复，避光静置 5-10 min 后，置于分光光度计下测定在 595 nm 处的吸光度，取 595 nm 处吸光值与对应标准蛋白浓度制作标准曲线，并计算待测样品的浓度。 6. 加 1/278 体积（36ul/10ml 蛋白提取物）的 1.25M DTT 至蛋白上清液，混合均匀，置于55 30min℃； 7. 冰浴使温度恢复至室温（不能太冰会沉淀）； 8. 加 1/10 体积（1ml）碘乙酰胺溶液，混匀，室温避光 15min； 9. 用 20mM HEPES PH8.0 稀释蛋白液 1:4 倍（30ml/10ml 蛋白提取物），至尿素终浓度至 2M； 10. 加 1/100 体积（100ul）的 1mg/ml trypsin-TPCK，室温过夜（37℃培育箱 14-18h）； 二、裂解肽段的纯化1. 在样品中加 1/20 体积（2ml）的 20% TFA 至 终浓度为 1%进行酸化，用 pH 试纸条测 pH< 3。冰浴 15min，生成沉淀； 2. 室温 5000g 离心 15min，取上清至新的 50ml 离心管； 3. 把 10ml 的注射器安装到 Sep-Pak 柱的短端，5ml 100% 乙腈预湿；4. 用 1ml，3ml，6ml Solvent A（0.1%TFA）依次过柱清洗；5. 加入酸化的酶解产物（样品）；6....