PCR实验室操作流程

乙型肝炎病毒(HBVDNAPCRABI7300)检侧标准操作程序一、INFORMATIONFORTEST 检测信息项目名称乙型肝炎病毒核酸方法聚合酶链反应方法依据卫 生 部 《 全 国 临 床 检 验 操 作 规 程 》 第 三 版（2025）第七篇第六章第一节二、ANALYTICALPRINCTPLE 检测原理聚台酶链式反应(PCR〕可对特定核苷酸片段进行指数级的扩增，而实时荧光定量 PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质,荧光物质有两种：荧光探针和荧光染料.我们目前是使用 TaqMan 荧光探针的检测原理：PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR 扩增时，Taq 酶的 5'一 3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，荧光信号强度也等比例增加（图一)。这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。三、操作步骤（一）试剂配制1、进入试剂准备区，开启冰箱冷冻层取出 HBV—DNA 检测试剂盒.查看外包装盒（包括生产批号、有效期)，无误后拆开试剂盒,取出核酸提取液、反应液及 Taq 酶（核对核酸提取液、HBVPCR 反应液及Taq 酶管上批号与试剂外包装盒批号是否一致）(图 1）,不一致则不可使用，需更换新的试剂。室温平衡 20min，完全融化后 2000rpm 离心备用。2、核酸提取液的分装（1）取 0。5ml 离心管架置于超净工作台内(开机前用紫外线消毒 30分钟)，用右手拿起镊子逐个将离心管放入离心管架（注意应夹住离心管外壁，不能碰到管内壁）,摆放顺序为横列从左往右摆，竖列为从上往下隔行排,离心管个数为 n（n=样本数+对比品+质控品）。完成后将镊子放回原位（图 2）.（2）用移液器准确吸取核酸提取液 50ul 分装至 0.5m1 离心管中(左上角第一排开始，从左住右依次加入）.因核酸提取液内含固体沉淀颗粒物，为使颗粒均匀分布，故每次取样时都要用移液器反复吸打3-4 次（图 3）.分装完毕后将移液器量程归位。（3）加完一架后用右手拿镊子将离心管拿起，左手大拇指和中指夹紧离心管下部，然后用食指将盖子盖上，顺...