基于分子生物学的长江口外海域中微生物鉴定摘要：作为国家卫星海洋中心组成部分，本论文主要是初步查明秋季长江口外海域海洋悬浮物中的微生物种类。2008年秋季，我们在长江口外海域采集的海洋悬浮物样品，利用对海洋微生物16SrRNA基因的直接扩增，克隆和测序，从而鉴定微生物的种类。通过开展本研究，我们希望能初步查明长江口外海域海洋悬浮物中的微生物种类，为建立海洋微生物分子生物学检测的技术体系打下一定的基础。关键词：海洋微生物，种类鉴定，16SrRNA，海洋悬浮物IdentificationsofMicroorganismfromtheOutsidewatersofChangjiangRiverEstuarybyMolecularBiologyTechniquesAbstract:BeingasamajorpartofSatelliteOceanCenterofChina,thisstudyistryingtoprimarilyinvestigatethemicroorganismspeciesintheSuspendedsolidsfromtheOutsidewatersofChangjiangRiverEstuary。Infallin2008,wecollectedSuspendedsolidssamplesfromthebiologyinvestigationspot24ofSatelliteOceanCenterofChina,thenidentifiedthemarinemicroorganismspeciesbyusingdirectamplificationsof16SrRNAgenefrommarinemicroorganism,cloningandsequencingtechniques.Inthisstudy,wehopetoidentifythemarineorganismspeciesinsedimentfromtheChinaEastSeaneartoShanghai,whichcouldprovidebasisfortheestablishmentsofmarinemicroorganismmoleculardetectiontechniquesystem.Keywords:Marinemicroorganism,speciesidentification,16SrRNA,marinesediments基于分子生物学的长江口外海域中微生物鉴定DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。电源电压在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温.三、琼脂糖凝胶的制备1、取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg/ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。4.微生物种类的鉴定方法4.1微生物的鉴定技术分类分类鉴定方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类,分成4个水平：细菌形态和生理生化水平、细胞组分水平、蛋白质水平和核酸水平。4.1.1表型鉴定法它是对前3个水平的鉴...
