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荧光显微镜检测方法(以96孔板，A549贴壁细胞为例)细胞培养取对数生长期细胞，以每孔4×103~1×105细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。药物处理(可选)客户可以根据实验需要进行各种药物处理。EdU标记1.1用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μMEdU培养基；注：1)EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育育(>24h)宜采用低浓度(1~10μM)；2)如果需配置10μMEdU培养基，需调整为5000：1稀释比例；3)配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质。表1EdU培养基及染色反应液的使用量参考(<2h)宜采用高浓度(10~50μM)，长时间孵EdU培养基染色反应100μl150μl200μl300μl500μl2mL液100μl150μl200μl300μl500μl2mL注：1)*表示贴壁细胞通常采用的培养容器，EdU培养基与染色反应液用量以覆盖细胞为宜；2)悬浮细胞EdU用量依据培养体积而定。1.2每孔加入100μL50μMEdU培养基孵育2小时，弃培养基；注：1)最佳孵育时间与细胞周期相关(表2)，大多数细胞系均可采用2小时孵育时间；EdU孵育时间内的营养物质持2)EdU培养基用量以没过细胞为宜，但需要保证续供给(表1)；注：清洗目的是将未渗入1.3PBS清洗细胞1~2次，每次5分钟。不牢的细胞请降低清洗强度。DNA的EdU洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型而定，贴壁表2EdU孵育时间设定参考人成纤维细人宫颈癌细胞~21h2h细胞系人胚胎细胞酵母细胞~3h20min胞~18h2h人胚肾细胞系人神经细胞~5d1d细胞周期孵育时间~30min5min～25h2h注：1)EdU孵育时间取决于细胞周期，一般为细胞周期的1/10至1/5，但大多数细胞系均可采用2h孵育时间。孵育时间越长，细胞增殖数量就越多；2)*考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等其他因素的影响，具体实验的细胞群体细胞周期会有所变化。表3细胞实验EdU孵育浓度及时间参考SalicA,etal.PNAS.2008CappellaP,etal.CytometryANIH3T3,HelaHL-60,U2OSA2780,10nM~10μM1~10μM1hr30min.2008Chehrehasa2009F,etal.JNeurosciMethods.Neurospheres1~20μM24hrLimsirichaikulS,etal.Nucleic2009AcidsRes.Primaryfibroblasts10μM1,2,4hr4hr24hr30min12hr2hr2hr3hrWarrenM,etal.DevDyn.2009YuY,etal.JImmunolMethodsMomcilovi?O,etal.StemCellsCinquinO,etal.PNAS.2010ChickembryosSpleencellsHumanEScellsemb-30VSMC.2010ESCfissionstrainsEJcellsGCcells.201110μM~2mM50μM10μM1μM50μM50μM.2009.2009HanW,etal.LifeSci.2009HuangC,etal.JGenetGenomicsHuaH,etal.NucleicAcidsRes.2011yeast10μMLvL,etal.MolCellBiochemYangS,etal.BiolReprod.2011.201150μM50μM30μM50μM25μM10μM50μM25μM50μM50μM4hr2hr90min4hr2hr24hr4hr24hr2hr2hrZhangYW,etal.NucleicAcidsResGuoT,etal.PloSOne.2011ZengT,etal.PloSOne.2011DingD,etal.IntOrthop.2011U2OS,HT29HIT-T15MCF-10AC3H10T1/2EPCSGC7901MSCZengW,etal.Biomaterials.2011XueZ,etal.JCellBiochemPengF,etal.LasersMedSci.2011.2011LiD,etal.JBiolChem.2011HCC注：如果您有采用BrdU进行实验的经验，可以参照BrdU实验的相关参数进行EdU实验。细胞固定化2.1每孔加入50μL细胞固定液(即含4%多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟，弃固定液；注：1)低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持，透化细胞以利于抗体进入细胞内。2)可采用其他方式进行细胞固定。2.2每孔加入50μL2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；当需要抗体染色时，需采用TritonX-100注：目的是中和多聚甲醛，保证染色反应体系，当采用其他方式进行细胞固定时可酌情省略此步骤；2.3每孔加入100μLPBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS；2.4(加强)每孔加入100μL渗透剂(0.5%TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟;PBS清洗1次，5分钟。注：当实验需要进行其他抗体染色时，要增强细胞膜通透性。普通细胞可以省略。Apollo染色3.1每孔加入100μL的1XApollo?染色反应液(表3)，避光、室温、脱色摇床孵育后，弃染色反应液；注：1)染色液用量与细胞量相关，以覆盖细胞为宜2)孵育时间可以进行适当调整，调整范围为(表1)；或由于某些细胞类型对染料的吸附性较高，可能需30分钟10~30分钟。表4Apollo?染色反...