考马斯亮蓝R250染色法观察细胞骨架VIP免费

考马斯亮蓝R250染色法观察细胞骨架高熹1120152430（李安一）（北京理工大学生命学院16121501班）摘要：狭义的细胞骨架概念是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系微管、微丝及中间纤维组成的体系。考马斯亮蓝R250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合的一种物质，用于微量蛋白质染色。该实验通过植物和动物细胞的细胞骨架染色，观察细胞骨架，使我们掌握了动植物细胞内微丝的染色方法。关键词：细胞骨架；考马斯亮蓝；微丝；染色；实验1引言由微管、微丝和中间丝所组成的蛋白纤维网架结构体系称为“细胞骨架系统”，与细胞内的遗传系统、生物膜系统、并称“细胞内的三大系统”。是真核细胞借以维持其基本形态的重要结构，被形象地称为细胞骨架，它通常也被认为是广义上细胞器的一种。广义的细胞骨架概念是细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和胞外基质所形成的网络体系。核骨架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接，贯穿于细胞核和细胞质的网架体系。细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网络结构。发现较晚，主要是因为一般电镜制样采用低温（0-4℃）固定，而细胞骨架会在低温下解聚。直到20世纪60年代后，采用戊二醛常温固定，才逐渐认识到细胞骨架的客观存在。真核细胞借以维持其基本形态的重要结构，被形象地称为细胞骨架，它通常也被认为是广义上细胞器的一种。细胞骨架不仅在维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用，而且还参与许多重要的生命活动，如：在细胞分裂中细胞骨架牵引染色体分离，在细胞物质运输中，各类小泡和细胞器可沿着细胞骨架定向转运；在肌肉细胞中，细胞骨架和它的结合蛋白组成动力系统；在白细胞(白血球)的迁移、精子的游动、神经细胞轴突和树突的伸展等方面都与细胞骨架有关。另外，在植物细胞中细胞骨架指导细胞壁的合成。微丝普遍存在于所有真核细胞中，是一个实心状的纤维，直径为4nm-7nm一般细胞中含量约占细胞内总蛋白质的1%-2%，但在活动较强的细胞中可占20%-30%。在一般细胞主要分布于细胞的表面，直接影响细胞的形状。微丝具有多种功能，在不同细胞的表现不同，在肌细胞组成粗肌丝、细肌丝，可以收缩（收缩蛋白），在非肌细胞中主要起支撑作用、非肌性运动和信息传导作用。微丝主要由肌动蛋白构成，和肌球蛋白一起作用，使细胞运动。它们参与细胞的变形虫运动、植物细胞的细胞质流动与肌肉细胞的收缩。微丝是双股肌动蛋白丝以螺旋的形式组成的纤维，直径为7纳米，螺距为36纳米，两股肌动蛋白丝是同方向的。肌动蛋白纤维也是一种极性分子，具有两个不同的末端，一个是正端，另一个是负端。微丝与它的结合蛋白以及肌球蛋白三者构成化学机械系统，利用化学能产生机械运动。由微丝形成的微丝束称为应力纤维，常横贯于细胞长轴。脊椎动物肌动蛋白分为α、β和γ三种类型，α型分布于心肌和横纹肌细胞中，α及γ型分布于平滑肌细胞中，β及γ型分布于非肌细胞中。聚合的及非聚合态的肌动蛋白能与其多种结合蛋白相互作用，这些结合蛋白对肌动蛋白的聚合及对微丝的稳定、长度及分布具有调节作用。考马斯亮蓝R-250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合，尤其适用于微量蛋白质染色。它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色，并且在比较宽的范围内（15—20g），扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。一般当细胞充分铺展时，经考马斯亮蓝R250染色，可看到沿细胞长轴伸展的粗大纤维束，即应力纤维。应力纤维上还周期性地分布着微丝结合蛋白，包括-辅肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、类肌钙蛋白等。应力纤维的端部连接着质膜上的粘着斑，与加强细胞对基质的附着、铺展及维持细胞特定形状有关。考马斯亮蓝R250可以染各种蛋白，并非特异染色微丝，实验中用1％TritonX－100抽提掉胞质中除骨架蛋白外的其他蛋白，能清晰地显示微丝束。2实验器材及试剂2.1器材光学显微镜、温箱、细胞培养设备、平皿、直径30mm小染缸、载波片、盖玻片条（剪掉一角以区别细胞正反面）。2.2材料体外培养的贴壁生长的HeLa细胞、洋葱鳞茎。2.3试剂细胞培养基（DMEM、RPMI－1640等）、磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH7.4）、0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7.3）、M－缓冲液、1％TritonX-100（用M...