木瓜蛋白酶的分离纯化一、目的（1）它是利用未成熟的番木瓜（Caricapapaya）果实中的乳汁中提取粗酶液，并进一步纯化，获得高纯度的木瓜蛋白酶。（2）通过此次试验，熟悉掌握木瓜蛋白酶分离纯化的基本步骤和原理，了解离心分离，萃取等实验技术。二、原理木瓜蛋白酶（Papain）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。它也具有脂酶活力。其分子量约为23000左右。在25℃,时，1分钟生成1umol酪氨酸的酶量为1单位。木瓜蛋白酶是单条肽链，有211氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有1个巯基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸，硫化物，亚硫酸盐和EDTA；抑制剂有巯基试剂，包括重金属和羧基试剂和过氧化氢。酪蛋白是一种蛋白质，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275nm处有吸收峰，根据测定275nm处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。三、实验材料番木瓜汁；PEG(聚乙二醇，分子量为6000)；(NH4)2SO4；三氯乙酸(TCA)；酪氨酸；考马斯亮蓝四、仪器设备（1）离心机4000-1000rpm（冷冻式或非冷冻式）（2）752紫外分光光度计（3）水浴箱（4）冰箱（5）榨汁机五、玻璃器皿（以组为单位）试管（6），100mL烧杯（2），吸管（1）、玻棒（1），试剂瓶（1000mL、500mL、250mL等），移液管或移液器5mL(1)、1mL(2)、（1），漏斗（3），滤纸（3-6）等六、实验试剂配制及实验步骤（一）酪氨酸的标准曲线试管编号标准酪氨酸溶液(ml)蒸馏水（ml）002123451紫外吸光度A275nm0将上述各管混匀，静置2min,测定各管的A275nm，做标准曲线，曲线如下：酪氨酸曲线0.60.50.4OD0.30.20.1000.010.020.03g/Ly=10.496x+0.0139R2=0.99370.040.050.06（二）粗酶活测定1试剂（1）3mg/ml木瓜蛋白酶液（用L的磷酸缓冲液，pH配制）（2）L的磷酸缓冲液，pH（3）用L磷酸缓冲液（pH）配制含80mmol/L半胱氨酸（4）1%酪蛋白溶液：用L磷酸缓冲液（pH）配制（5）15%三氯乙酸（TCA）溶液2方法量取酶液mL，加入激活剂mL于带塞试管中，在37℃水浴中保温8min，吸取预热37℃酪蛋白液（质量分数为1%）1mL加入此管，在37℃水浴中反应10min，加入三氯乙酸（TCA）2mL摇匀，静置5min；另取样液（已激活）mL置另一带塞试管中，加入TCA2mL，37℃保温10min后，加入预热至37℃的酪蛋白液1mL，静置5min，测2个管的A275nm值，同时做2个平行试验。管号酶液（ml）激活剂（ml）0（对照）37度预热10分钟1%酪蛋白（ml）037度水浴10分钟TCA（ml）1%酪蛋白（ml）001（样品）2(样品)摇匀，静置5分钟过滤OD275nm（三）纯化固定体系总质量为g，在PEG（分子量6000）质量分数为%，(NH4)2SO4质量分数为%，pH值为，粗酶添加量为%所组成的双水相体系下，室温下静置分相后，读取上、下相体积，计算相体积比R，分别测定上、下相的酶活力体积ml紫外吸光度A275nm上相9下相17（四）计算与结果R=9/17=粗酶活=（–）/*100000/=上相酶活=（–）/*100000/=下相酶活=（–）/*100000/=酶分配系数=上相酶活/下相酶活=/=
