蓝藻蛋白的分离与纯化VIP免费

一、实验目的和要求1、了解藻蓝蛋白的生理意义及功能，藻蓝蛋白一般的提取和纯化的方法；2、掌握蛋白含量测定方法；掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的实验技术。二、实验原理藻蓝蛋白（PC）是一类普通存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素，也是一种天然色素蛋白，具有水溶性，可用作食品着色剂。此外，它具有强烈的荧光，在分子生物学上被制成荧光探针，是一种无毒、无副作用的理想光敏剂。藻蓝蛋白还具有重要的医疗价值，不但能提高机体细胞的非特异性免疫功能，而且对特异性免疫功能有促进作用。另外，它还具有清除自由基的能力，可以抗疲劳，延缓衰老，对人体的生理功能有重要的生物学意义。利用盐析沉淀蛋白质的基本原理：盐在水溶液中电离所形成的正负离子ＮＨ可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同研究表明可用25%(NH4)2SO4饱和度沉淀除去杂质，55%(NH4)2SO4沉淀藻蓝蛋白。盐析出来的蛋白质，需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。最常用的脱盐方法是透析。蛋白质是大分子物质，它不能透过半透膜，而小分子物质可以自由透过半透膜，顾不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂质透析掉。蛋白含量的测定有紫外分光光度计法和显色法（Folin-酚法、考马斯亮蓝法等）本实验采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的，含量，考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用后变为蓝色，最大光吸收由465nm变为595nm，在一定范围内，蛋白质的含量与595nm处吸光值成正比。离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有弱酸性的二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团结合，结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力。因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变PH或离子强度来实现，与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。本实验以蓝藻为材料，采用反复冻融、分步盐析法对藻蓝蛋白进行提取和初步纯化，采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量，然后使用DEAE-纤维素柱层析对提取的藻蓝蛋白进一步纯化（由于来源不同和种类的差别，目前研究报道的藻蓝蛋白等电点尚无一致结论，但都在3.4-4.8之间，其中钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的等电点为4.3，在PH6.5磷酸盐缓冲液中带负电，所以选择DEAE-纤维素阴离子交换柱）。预期得到纯度较高的藻蓝蛋白。三、试剂与仪器1、试剂螺旋藻藻粉0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PH6.5）、标准蛋白（0.1mg/L）、考马斯亮蓝G-250、0.5mol/LNaOH、0.5mol/LHCl、NaCl、0.5mol/LHCl、NaCl、硫酸铵、透析袋、DEAE纤维素、奈氏试剂四、实验步骤（一）、藻蓝蛋白的提取及初步纯化1、藻蓝蛋白抽提：采用反复冻融法破碎细胞，磷酸盐缓冲液浸提蛋白。具体操作：取螺旋藻粉1g，加入0.01mol/LPH6.5的磷酸盐缓冲液10mL，充分搅拌混匀。室温浸泡30min-1h后，在-20℃和38℃之间反复冻融数次（3-5次）。细胞破碎后，将悬浮液移入离心管，加入10mL0.01moL/LPH6.5的磷酸盐缓冲液，混匀，静止30min，4000r/min离心20min，上清液即为抽提得到的藻蓝蛋白混合液。2、分步盐析：采用不同浓度的硫酸铵分步盐析初步纯化出藻蓝蛋白。具体操作：取上清液，用25%饱和度的硫酸铵4℃盐析30min，然后4000r/min离心20min，所得上清液用55%饱和度的硫酸铵放入冰箱盐析30min，4000r/min离心20min，弃去上清液，离心收集得到沉淀即为藻蓝蛋白。3、透析去盐得到的沉淀用10mL0.01moL/Mlph6.5的磷酸盐缓冲液溶解，然后将藻蓝蛋白粗提液置于透析袋（截留分子质量为10Kd）中在蒸馏水中透析以去除盐离子。每隔1h换一次透析液，换3-4次。(二)藻蓝蛋白含量测定1、制作标准曲线；2、样品含量测定；3、计算结果。具体操作步骤如下：取洁净干燥的试管若干，按表1-1比例配置标准蛋白溶液。原本标准蛋白的浓度为0.1mg/mL。表1-1标准溶液配置管号标准蛋白（mL）蒸馏水（mL）10120.20.830.40.64...