第1页共14页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第1页共14页中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中心教案授课科目:医学分子生物学授课内容:基因工程与体外表达授课对象：医学七年制、八年制授课时数：6学时授课教师：曾海涛授课地点：授课时间：授课教材：医学分子生物学（21世纪高等院校教材）胡维新主编，北京：科学出版社，2007，第一版第八章基因工程与体外表达一、目的要求：掌握：常用克隆载体；基因克隆的基本过程；外源基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达的原理和方法。熟悉：限制性核酸内切酶和其他常用工具酶的概念和特点；定点诱变技术原理。了解：昆虫表达系统；酵母表达系统。二、讲授重点：基因克隆的基本过程。三、讲授难点：第2页共14页第1页共14页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第2页共14页α－互补筛选；阳性转染细胞的筛选；定点诱变技术原理。四、教学方法：多媒体教学五、教具：多媒体课件六、讲授内容：第一节基因工程中的工具酶一、限制性核酸内切酶（restrictionenzyme）限制性核酸内切酶是基因克隆中最重要的工具酶，主要从原核细胞中提取。它是一种核酸内切酶，能从双链DNA内部特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。1．限制性核酸内切酶的分类Ⅰ型酶具有限制和DNA修饰作用。这种酶在非特异性位点,通常在识别位点下游100到1000bp处切割DNA。Ⅱ型酶能在DNA分子内部的特异位点，识别和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。Ⅲ型酶与Ⅰ型酶一样，具有限制与修饰活性，能在识别位点附近切割DNA，切割位点很难预测。2．限制性内切酶的命名EcoREⅠ代表Escherichia属co代表coli种R代表RY13株3．限制性内切酶的识别和切割位点通常是4～6个碱基对、具有回文序列（palindrom）的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5ˊ或3ˊ粘性末端（stickyend）。如EcoRⅠ切割后产生5ˊ粘性末端.PstⅠ切割后产生3ˊ粘性末端.有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端（Bluntend）,如Sma.Ⅰ二、其他常用的工具酶1.DNA聚合酶Ⅰ(DNApolymeraseI)有聚合酶活性,3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性,5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性。2.DNA聚合酶Ⅰ大片段DNA聚合酶Ⅰ大片段(largefragmentofDNApolymeraseI)为DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片段也称为Klenow片段（Klenowfragment）。有5ˊ→3ˊ聚合酶活性,3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性,无5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性Klenow片段的主要用途有：(1)补齐双链DNA的3ˊ末端。(2)通过补齐3ˊ端，使3ˊ末端标记。(3)在cDNA克隆中，第二股链的合成。(4)DNA序列分析。3.逆转录酶（reversetranscriptase）第3页共14页第2页共14页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第3页共14页是一种RNA依赖的DNA聚合酶，即以RNA为模板合成DNA，合成时需要四种脱氧核苷酸及3ˊ-OH引物，合成方向为5ˊ→3ˊ延伸，无3ˊ→5ˊ外切酶活性广泛用于以mRNA为模板合成cDNA，构建cDNA文库。4.T4DNA连接酶（T4DNAligase）T4DNA连接酶催化双链DNA一端3ˊ-OH与另一双链DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNA两端连接起来。5.碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）能去除DNA或RNA5ˊ端的磷酸根。制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。6.末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT），简称末端转移酶。它的作用是将脱氧核苷酸加到DNA的3ˊ-OH上，主要用于探针标记；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。第二节基因克隆的载体外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果将其直接导入宿主细胞，没有有效的方法将导入了外源DNA片段的细胞和没有导入外源DNA的细胞区分开来。此外，外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细胞的繁殖而复制，即没有自主复制能力，达不到使外源DNA片段扩增的目的。如果要将外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达，就需要有一个能在该宿主细胞内进行自我复制和表达的载体(vector)来携带。外源DNA片段与载体在体外连接，构成重...
