地高辛标记探针的Southern杂交(DIGHighPrimerDNALabelingandDetectionStarterKitI,Cat.No.11745832910,RocheDiagnosticsGmbH,Germany)1.探针标记步骤(20µl体系):1)将10ng-1µg模板DNA用无菌去离子水补足至16µl。2)沸水浴或干浴锅98℃10分钟,使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。3)充分混匀DIG-highPrimer(1#管),并取4µl至变性DNA管,混匀并离心。4)37℃温育1小时或过夜(最大到不超过20小时)。5)停止反应,加2µl0.2MEDTA(pH8.0)或65℃加热10分钟。2.探针标记效率检测:将地高辛标记好的探针作一系列的稀释,点到一条尼龙膜上,同时用地高辛标记的controlDNA作对照标准,120℃固定30分钟;然后用地高辛抗体免疫检测,按BNT/BCIP显色步骤显色;比较显色结果,选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。操作步骤如下:1)根据表1DIG-HighPrimeDNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记产量将标记的探针稀释到1ng/μl,将试剂盒提供的controlDNA稀释到1ng/μl(原始浓度是5ng/μl),然后按照表2作一系列的稀释探针及controlDNA表1DIG-HighPrimeDNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量TemplateDNA1h20h10ng45ng600ng30ng130ng1050ng100ng270ng1500ng300ng450ng2000ng1000ng850ng2300ng3000ng1350ng2650ng表2探针DNA及ControlDNA系列表TubeDNA(µl)FromTube#DNAdilutionbuffer(μl)DilutionFinalconcentration1Diluted1ng/µlorginal2211981:10010pg/µl3152351:3.33pg/µl452451:101pg/µl553451:100.3pg/µl654451:100.1pg/µl755451:100.03pg/µl856451:100.01pg/µl90-50-02)将上述稀释的2-9号管的controlDNA及探针DNA各取1μl点膜3)120℃固定30分钟或紫外交链3-5分钟4)将膜放入装有20mlMaleicacidbuffer的塑料器皿中,室温振荡2分钟5)将膜放入10mlBlockingsolution中室温温育30分钟6)将膜放入10mlAntibodysolution中室温温育30分钟7)用10mlWashingbuffer洗2次,每次15分钟8)在10mlDetectionbuffer平衡2-5分钟9)将膜放入2ml新配制的Colorsubstratesolution中暗室条件下显色。显色过程中不要摇动或振荡10)当斑点或带显示出来后,用50ml灭菌的双蒸水洗膜5分钟,照相染色至0.1pg的ControlDNA出现斑点,比较标记的探针与ControlDNA染色情况计算出地高辛标记的DNA的量:如果0.1pg的探针及对照稀释点都显色,则探针标记理想;如果0.1pg的对照显色,0.1pg的标记探针没显色,但0.3pg显色,则计算探针浓度(约为理想浓度的1/3)以确定杂交时加多少探针(25ng探针/ml杂交液);如果0.1pg的对照显色,但标记探针0.3pg的斑点没显色,则应重新标记探针。(转膜被省略。)去嘌呤缓冲液:placethegelinaplastictray.coverwith250mMHCl.agitategentlyuntilthebromophenolbluedyeturnsyellow(5minutes).agitateafurther15minutesandrinsewithdistilledwater.碱变性液:1.5mol/LNaCl,0.5mol/LNaOH中和液:0.5mol/LTris-HCL(pH=8.0),1.5mol/LNaCl20×SSC:2mol/LNaCl,0.3mol/L柠檬酸钠(pH=7.0)2×SSC:0.3mol/LNaCl,0.03mol/L柠檬酸钠(pH=7.0)关于凝胶处理:1,凝胶放入大培养皿,加变性液没过凝胶,脱色摇床轻微摇动,1h,期间更换一次变性液;2,倾倒变性液,用无菌超纯水漂洗一次;3,(先清洗培养皿),加中和液,脱色摇床轻微摇动,1h,期间更换一次中和液;关于印记:1,取方玻璃盘,加入适量20×SSC;2,在方盘上架一玻璃板(注意清洁),玻璃板上铺一Whatman3MM滤纸,两端没入20×SSC中,滤纸和玻璃板之间不要留有气泡;3,取中和后的凝胶,点样孔向下地放在Whatman3MM滤纸上,用玻璃棒滚动去除胶与滤纸之间的气泡;4,剪一块与胶大小一致的尼龙膜(带正电荷),放在无菌超蒸水表面,使之自然吸水下沉;5,将膜转入20×SSC中浸泡5min;6,将浸润的膜准确地盖在凝胶上面,膜与凝胶接触后,不再移动;7,将两张与膜大小相同的Whatman3MM滤纸置于2×SSC溶液中浸润,盖在膜上,排除气泡;8,滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸,吸水纸上放一块大小合宜的玻璃板,玻璃板上压0.5kg重物,水平放置,转移12-20h;9,取下吸水纸及滤纸,揭去胶,将尼龙膜于2×SSC中浸泡5mi...