地高辛标记探针的Southern杂交（DIGHighPrimerDNALabelingandDetectionStarterKitI，Cat.No.11745832910，RocheDiagnosticsGmbH，Germany）1.探针标记步骤（20µl体系）：1)将10ng-1µg模板DNA用无菌去离子水补足至16µl。2)沸水浴或干浴锅98℃10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。3)充分混匀DIG-highPrimer（1#管），并取4µl至变性DNA管，混匀并离心。4)37℃温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）。5)停止反应，加2µl0.2MEDTA（pH8.0）或65℃加热10分钟。2.探针标记效率检测：将地高辛标记好的探针作一系列的稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的controlDNA作对照标准，120℃固定30分钟；然后用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色步骤显色；比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。操作步骤如下：1)根据表1DIG-HighPrimeDNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记产量将标记的探针稀释到1ng/μl，将试剂盒提供的controlDNA稀释到1ng/μl(原始浓度是5ng/μl)，然后按照表2作一系列的稀释探针及controlDNA表1DIG-HighPrimeDNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量TemplateDNA1h20h10ng45ng600ng30ng130ng1050ng100ng270ng1500ng300ng450ng2000ng1000ng850ng2300ng3000ng1350ng2650ng表2探针DNA及ControlDNA系列表TubeDNA(µl)FromTube#DNAdilutionbuffer(μl)DilutionFinalconcentration1Diluted1ng/µlorginal2211981:10010pg/µl3152351:3.33pg/µl452451:101pg/µl553451:100.3pg/µl654451:100.1pg/µl755451:100.03pg/µl856451:100.01pg/µl90-50-02)将上述稀释的2-9号管的controlDNA及探针DNA各取1μl点膜3)120℃固定30分钟或紫外交链3-5分钟4)将膜放入装有20mlMaleicacidbuffer的塑料器皿中，室温振荡2分钟5)将膜放入10mlBlockingsolution中室温温育30分钟6)将膜放入10mlAntibodysolution中室温温育30分钟7)用10mlWashingbuffer洗2次，每次15分钟8)在10mlDetectionbuffer平衡2-5分钟9)将膜放入2ml新配制的Colorsubstratesolution中暗室条件下显色。显色过程中不要摇动或振荡10)当斑点或带显示出来后，用50ml灭菌的双蒸水洗膜5分钟，照相染色至0.1pg的ControlDNA出现斑点，比较标记的探针与ControlDNA染色情况计算出地高辛标记的DNA的量：如果0.1pg的探针及对照稀释点都显色，则探针标记理想；如果0.1pg的对照显色，0.1pg的标记探针没显色，但0.3pg显色，则计算探针浓度（约为理想浓度的1/3）以确定杂交时加多少探针（25ng探针/ml杂交液）；如果0.1pg的对照显色，但标记探针0.3pg的斑点没显色，则应重新标记探针。（转膜被省略。）去嘌呤缓冲液：placethegelinaplastictray.coverwith250mMHCl.agitategentlyuntilthebromophenolbluedyeturnsyellow(5minutes).agitateafurther15minutesandrinsewithdistilledwater.碱变性液：1.5mol/LNaCl,0.5mol/LNaOH中和液：0.5mol/LTris-HCL(pH=8.0),1.5mol/LNaCl20×SSC：2mol/LNaCl,0.3mol/L柠檬酸钠（pH=7.0）2×SSC：0.3mol/LNaCl,0.03mol/L柠檬酸钠（pH=7.0）关于凝胶处理：1，凝胶放入大培养皿，加变性液没过凝胶，脱色摇床轻微摇动，1h，期间更换一次变性液；2，倾倒变性液，用无菌超纯水漂洗一次；3，（先清洗培养皿），加中和液，脱色摇床轻微摇动，1h，期间更换一次中和液；关于印记：1，取方玻璃盘，加入适量20×SSC；2，在方盘上架一玻璃板（注意清洁），玻璃板上铺一Whatman3MM滤纸，两端没入20×SSC中，滤纸和玻璃板之间不要留有气泡；3，取中和后的凝胶，点样孔向下地放在Whatman3MM滤纸上，用玻璃棒滚动去除胶与滤纸之间的气泡；4，剪一块与胶大小一致的尼龙膜（带正电荷），放在无菌超蒸水表面，使之自然吸水下沉；5，将膜转入20×SSC中浸泡5min；6，将浸润的膜准确地盖在凝胶上面，膜与凝胶接触后，不再移动；7，将两张与膜大小相同的Whatman3MM滤纸置于2×SSC溶液中浸润，盖在膜上，排除气泡；8，滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，吸水纸上放一块大小合宜的玻璃板，玻璃板上压0.5kg重物，水平放置，转移12-20h；9，取下吸水纸及滤纸，揭去胶，将尼龙膜于2×SSC中浸泡5mi...
