蛋白质的Wesrern印迹分析VIP免费

蛋白质的蛋白质的WesternWestern印迹分析印迹分析刘二战刘二战一、原理一、原理一个基因表达的最终产物是产生相应的蛋白，因此检测蛋白是测定基因表达的主要标志。原理：WesternBlotting是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离；并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜进行杂交，使其与膜上的靶蛋白特异性结合；再与经辣根过氧化物酶标记的二抗结合，最后用ECL试剂反应，经X线片曝光、显影等一系列反应，检测蛋白质等生物大分子。二、方法二、方法样品蛋白的制备SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳转膜检测三、样品蛋白的制备三、样品蛋白的制备1、原理：蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理只有两个方面：一是用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使备组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳、超速离心、超滤等。三、样品蛋白的制备三、样品蛋白的制备2、蛋白质制备的步骤（1）选择材料和预处理（2）细胞的破碎及细胞的分离（3）提取和纯化（4）浓缩、干燥和保存三、样品蛋白的制备三、样品蛋白的制备3、培养细胞中蛋白质样品的提取提取细胞蛋白多是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放的原理，在提取蛋白质的实验中要考虑到细胞裂解液的pH、去污剂的类型和浓度，以及二价阳离子、辅助因子等因素，同时为防止细胞内蛋白酶对蛋白质的降解，需在裂解液中加入蛋白酶抑制剂。三、样品蛋白的制备三、样品蛋白的制备3.1实验材料（1）器材：冷冻离心机，细胞刮，Tip头、1.5ml、0.5ml灭菌Ep管，碎冰。（2）试剂：①细胞总蛋白裂解液（100ml）:1×PBS80ml，Triton-1001ml,去氧胆酸钠0.5g,SDS0.1g,补1×PBS缓冲液至100ml。②PMSF贮存液（PMSF17.4mg/异丙醇）：PMSF（苯甲基磺酰氟）在水溶液中不稳定，应在临用前向不含PMSF的裂解缓冲液中加入PMSF贮存液100ul,使其终浓度为0.174mg/ml。（3）Hela细胞三、样品蛋白的制备三、样品蛋白的制备3.2实验方法（1）洗涤细胞：选取细胞培养皿中培养的Hela细胞，由37℃取出后放入冰盘中，预冷。吸弃原培养液，用4℃预冷的1×PBS洗细胞表面3～4次，除净培养基中的血清，并尽量吸弃细胞培养皿中残余的PBS。（2）向培养皿中加入蛋白裂解液(100ul/60mm)，轻轻晃动，使裂解液均匀铺于细胞表面。（3）冰浴30～60min，期间晃动3～4次。（4）用细胞刮子集中裂解液，收集入冰上预冷的1.5mlEp管中，4℃离心，12000g20min.（5）小心吸取上清液入新的预冷管中（为避免反复冻融导致蛋白降解，可按需要将其分装使用），-80℃保有存备用（可保存1年）三、样品蛋白的制备三、样品蛋白的制备3.3注意事项（1）注意个人防护：PMSF严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收有致命危险。一旦眼晴或皮肤接触了PMSF，立即用大量清水冲洗。（2）设立必要实验对照。（3）为防止蛋白降解，上述操作全部应在冰上完成。（4）所用离心机需要提前预冷。（5）可于显微镜下观察细胸裂解的程度。（6）吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。三、样品蛋白的制备三、样品蛋白的制备4、蛋白质的浓度测定——考马斯亮蓝蛋白定量法考马斯亮蓝G－250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。4.1原理考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。三、样品蛋白的制备三、样品蛋白的制备4.2实验材料（1）器材：分光光度计及玻璃比色皿（2）试剂：①0.5%mg/mlBSA标准蛋白液：生理盐水配制，分装小管，4℃保存。②考马斯亮蓝G-250母液：称取考马斯亮蓝G-250100mg溶于50ml95%乙醇，加入100ml浓磷酸(W/V)...