第四章 DNA复制 王赟VIP免费

DNA复制DNA复制可能的三种方式由Meselson和Stahl设计证明半保留复制的实验的被誉为生物学最美丽的实验半保留复制实验亲代DNA；15N标记在15N标记培养基中培养：15N标记DNA移到14N标记DNA培养基中氯化铯密度梯度超离心•15NDNA在14NDNA培养基中培养第1~….n代亲代F1F2FnMeselson和Stahl的证明DNA半保留复制的实验流程Meselson和Stahl的实验结果Meselson与Stalh在42年以后在最初他们相遇的一颗树下重逢时的合影半保留复制的实验结果•15NDNA显示为一条重密度带位于离心管的管底。•15NDNA和14N-DNA的杂交分子中密度带。•第二代有中密度带及低密度带两个区带，这表明它们分别为15N14N－DNA和14N-DNA。•在14N培养基中培养代数的增加，低密度带增强，而中密度带逐渐减弱。半保留复制进一步的实验证椐•15NDNA、14NDNA杂交分子经加热变性，对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心。•结果变性前的杂交分子为一条中密度带，变性后则分为两条区带，即重密度带(15NDNA)及低密度带(14NDNA)。15NDNA第一代变性前后超离心15NDNA第一代：变性前变性后排除了弥散复制Taylor以蚕豆根尖细胞为材料、使用放射性同位素证明真核细胞DNA也是半保留复制的实验。DNA的半保留复制两条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。某些生物DNA复制的引物序列证明DNA复制的方向始终是5′→3′的末端终止实验DNA复制起始区的特征①由多个短的重复序列组成；②能够被多亚基的复制起始区结合蛋白识别；③通常富含AT碱基对，这有利于DNA复制起动时的解链，因为AT碱基对含有的氢键数目低于GC碱基对。DNA复制起始区的特征电镜下真核生物DNA的多个复制叉结构复制叉的结构当DNA复制从起始区起动的时候，起始区的DNA双链因发生解链而形成叉状结构，这样的结构被称为复制叉真核生物DNA复制子CairnsCairns的实验的实验复制开始时，将大肠杆菌放在含低剂量的[3H]-dT的培养基中培养几分钟；随后，将细菌转移到含高剂量的[3H]-dT的培养基中继续培养一段时间；最后，收集细胞，小心地裂解以抽取其中的染色体DNA进行放射自显影。如果是单向复制，自显影图谱上银颗粒的密度应该是一端高、一端低；如果是双向复制，则应该中间是一段低密度的银颗粒，两侧是高密度的银颗粒。低密度银颗粒意味着这一段DNA属于复制起始区，高密度颗粒代表的是后来合成的。Cairns证明大肠杆菌DNA双向复制的实验ReijiOkazakiReijiOkazaki的实验的实验脉冲标记——目的在于即时标记在特定时段内合成的DNA。和脉冲追踪——目的则是要弄清那些被标记上的DNA片段后来的去向。Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验脉冲标记•在培养时，培养基中加入同位素[3H]标记的dTTP，经30秒后，DNA刚开始复制，分离DNA，然后在碱中沉淀，变性，让新合成的单链和模板链分开，再用CsCl密度梯度离心，以沉降的快慢来确定片段的大小，再检测放射标记，结果表明被3H标记的片段，也就是新合成的片段，沉淀系数为20S左右，即都是长1000~2000Nt的DNA片段，而亲本链要比它大20~50倍；脉冲追踪•这个实验是先进行标记培养30秒，以后除去同位素继续培养几分钟，再分离DNA在碱中沉淀，检测结果。先合成的（带标记）的DNA不再是短片段，而和总DNA的情况相似，沉淀系数为70S~120S较长的片段，这意味着刚开始合成的片段都是短片段，以后再连接成长片段，人们就把最初合成的短片段称为冈崎片段（Okazakifragment）Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果分析不连续复制由于这个实验的结果使得人们普遍认为：无论是前导链还是后滞链都是先合成小片段，然后在连成大片段，称为“不连续复制“（discontinuousreplication）在复制叉中不连续合成的DNA片段称为冈崎片段，连续合成的DNA子链被称为前导链，不连续合成的DNA子链被称为后随链或滞后链。1978年Olivera提出了半不连续（semidiscontinuous）复制模型，也就是说前导链上的合成是连续的，只有后滞链上的合成才是半连续的。•由于细胞内都存在有dTTP和dUTP，而DNApolⅢ却并不能区分它们，因此也会将dUTP加入到DNA中，形成A·U对。那么在DNA中为什...