第五章扫描电镜生物样第五章扫描电镜生物样品制备技术品制备技术第一节常规生物样品第一节常规生物样品SESEMM制备技术制备技术FeaturesofSEMFeaturesofSEM高分辨率高分辨率FeaturesofSEMFeaturesofSEM强立体感强立体感FeaturesofSEMFeaturesofSEM广泛的放大倍率广泛的放大倍率FeaturesofFeaturesofSEMSEM应用范围广应用范围广生物、医学、动物、材料、化学、物理、地质、冶金、矿物、污泥(杆菌)、机械、电机及导电性样品如半导体电子材料等材料学土聚水泥制备扫描电镜样品的总要求在不损伤样品原始结构状态的情况下，保证样品的体积和表面积不发生改变，充分暴露样品表面的微细结构。生物样品的特性生物样品的特性含水量高含水量高质地柔软质地柔软导电性差导电性差二次电子产率低二次电子产率低对热、电子束等敏感对热、电子束等敏感扫描电镜生物样品要求：不含水份具有较高的二次电子发射率良好的导电性耐热性最大限度的保持样品的形貌扫描电镜样品常规制备的操作程序扫描电镜样品常规制备的操作程序1.取材2.清洗3.固定4.脱水5.干燥（置换）6.粘托7.镀膜（导电处理）一、取材取材要点：确定观察样品的目标要求及注意事项：做好充分准备（试剂、仪器、器械等）保护观察面，作好标记速度要快，每次取材数量不宜过多大小要合适10××10××5毫米避免拉割、挤压二、清洗清洗目的：去除观察面的杂质，充分暴露观察面方法：物理方法:漂洗、换洗、加压冲洗、振荡超声。化学方法:用酶消化法注意事项：在保证不破坏观察面的条件下，充分暴露观察面不要损伤观察面或者使样品膨胀、收缩等不要将样品裸露在空间，防止样品皱缩变型清洗液的选择清洗液的选择一般组织：等渗生理盐水一般组织：等渗生理盐水游离组织细胞：缓冲液、等张液游离组织细胞：缓冲液、等张液表面覆有大量黏液的组织（如胃肠粘膜）：表面覆有大量黏液的组织（如胃肠粘膜）：低浓度蛋白水解酶低浓度蛋白水解酶组织培养细胞：组织培养液组织培养细胞：组织培养液特殊样品：特殊洗液（如生药表面的蜡质，特殊样品：特殊洗液（如生药表面的蜡质，选用去垢剂选用去垢剂TritonX-100TritonX-100））三、固定目的：保存样品表面的真实结构；硬化组织，减少脱水干燥时水的表面张力对样品的损伤；提高样品的二次电子发射率；提高样品的耐热性和导电性。常用的固定剂：2.5%戊二醛（1～3h)1.0%四氧化锇(30’~1h)固定温度：室温，一般以4℃为宜。四、脱水要求：不改变样品的体积和表面积的情况下，去除样品中的水份。常用的脱水剂：乙醇、丙酮方法：梯度脱水时间：视样品大小而定注意事项：避免裸露，夹伤五、干燥干燥目的：去除样品中的脱水剂方法：空气干燥法、冷冻干燥法、叔丁醇干燥法、临界点干燥法等常用干燥法：叔丁醇干燥法、临界点干燥法空气干燥法空气干燥法方法方法：脱水至无水状态，为减缓其挥发速度，：脱水至无水状态，为减缓其挥发速度，退回至退回至85%85%脱水剂，取出，空气中自然干脱水剂，取出，空气中自然干燥。燥。优点优点：脱水剂为低表面张力物质，挥发过程：脱水剂为低表面张力物质，挥发过程中减少了样品的收缩及损伤中减少了样品的收缩及损伤缺点缺点：常常使样品发生变形收缩：常常使样品发生变形收缩适用范围适用范围：铸型或体表比较坚硬的甲壳昆虫：铸型或体表比较坚硬的甲壳昆虫等含水量较少的样品等含水量较少的样品冷冻干燥法冷冻干燥法方法方法：将含大量水分的生物样品迅速投入液：将含大量水分的生物样品迅速投入液氮中，使样品冷冻固化，而后将样品移入真氮中，使样品冷冻固化，而后将样品移入真空镀膜仪内，在高真空状态下升华，脱水剂空镀膜仪内，在高真空状态下升华，脱水剂直接由固态转为气态，样品随之得到干燥。直接由固态转为气态，样品随之得到干燥。优点优点：不存在气相与液相间的表面张力问题，：不存在气相与液相间的表面张力问题，故对样品损伤较小。故对样品损伤较小。缺点缺点：需特殊的低温条件，易出现冰晶损伤，：需特殊的低温条件，易出现冰晶损伤，费时。费时。适用范围适用范围：含水量较多的生物样品：含水量较多的生物样品叔丁醇干燥法叔丁...
