生物显微技术 第五章 原位杂交VIP免费

原位杂交组织化学原位杂交组织化学核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术固相杂交固相杂交::菌落原位杂交（菌落原位杂交（colonyinsituhybridizatiocolonyinsituhybridizationn））斑点杂交法（斑点杂交法（DotblotDotblot））SouthernSouthern印迹杂交（印迹杂交（SouthernblotSouthernblot））NorthernNorthern印迹杂交（印迹杂交（NorthernblotNorthernblot））组织原位杂交（组织原位杂交（TissueinsituhybridizatioTissueinsituhybridizationn））液相杂交液相杂交定义：特定标记的已知序列的核酸作为探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对标记的探针进行检测的方法称为原位杂交。DetectionofDNAbynucleicacidhybridization分类分类核酸探针标记方法：核酸探针标记方法：1.1.放射性探针：放射性探针：3232PP33HH3535SS2.2.非放射性探针：生物素、地高辛非放射性探针：生物素、地高辛探针的核酸性质不同：探针的核酸性质不同：1.1.DNADNA探针：探针：单链单链DNADNA（（Singlestranded,ssDNASinglestranded,ssDNA））和双链和双链DNADNA（（Doublestranded,dsDNADoublestranded,dsDNA））2.2.cDNAcDNA探针：探针：complementaryDNAprobecomplementaryDNAprobe3.3.cRNAcRNA探针：探针：complementaryRNAprobecomplementaryRNAprobe4.4.寡核苷酸探针寡核苷酸探针原理原理探针标记：同位素标记和非同位素标记探针标记：同位素标记和非同位素标记的探针（生物素标记和地高辛标记）的探针（生物素标记和地高辛标记）探针与靶序列根据碱基互补配对原则特探针与靶序列根据碱基互补配对原则特异性结合异性结合检测标记的探针：放射自显影、荧光检检测标记的探针：放射自显影、荧光检测和酶法检测。测和酶法检测。优点优点不需要从组织中提取核酸，对组织中含量不需要从组织中提取核酸，对组织中含量极低的靶序列具有极高的敏感性。极低的靶序列具有极高的敏感性。能够完整的保持组织和细胞的形态，能更能够完整的保持组织和细胞的形态，能更准确地反映组织细胞的功能状态以及功能准确地反映组织细胞的功能状态以及功能上的相互联系。上的相互联系。应用应用特定的核酸序列在染色体中的精确定位。特定的核酸序列在染色体中的精确定位。与细胞内的与细胞内的RNARNA杂交观察该基因的定位、定量杂交观察该基因的定位、定量表达。表达。用特异性的细菌或病毒的核酸作为探针对组织用特异性的细菌或病毒的核酸作为探针对组织或细胞进行杂交，以确定有无病原体的感染。或细胞进行杂交，以确定有无病原体的感染。原位杂交流程原位杂交流程探针的标记探针的标记取材取材切片切片::石蜡切片冰冻切片石蜡切片冰冻切片杂交前预处理杂交前预处理杂交杂交杂交后洗去未结合的及非特异性结合的探杂交后洗去未结合的及非特异性结合的探针针探针的检测探针的检测探针的标记缺刻平移法标记DNA探针DNANicktranslationDNARandomprimedlabelingRNAprobelabelingRNAprobelabeling原位杂交条件的选择原位杂交条件的选择增强组织的通透性和核酸探针的增强组织的通透性和核酸探针的穿透性穿透性TritonX-100TritonX-100消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（酶和淀粉酶（diastasediastase）等）等消化消化乙酰化：浸入乙酸酐和三乙醇胺中以减低乙酰化：浸入乙酸酐和三乙醇胺中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。景染色。杂交杂交杂交的温度杂交的温度TmTm：：能使能使50%50%的核苷酸变性解链所需的温度，叫解链的核苷酸变性解链所需的温度，叫解链温度或融解温度（温度或融解温度（meltingtemperature,meltingtemperature,简称）。简称）。TmTm相关因素：相关因素：CGCG含量；核酸的匹配程度；含量；核酸的匹配程度；DNADNA探针：探针：TmTm是是9090℃℃，，RNARNA探针：探针：TmTm是是9595℃℃。。甲酰胺可降低杂交甲酰胺可降低杂交TmTm：：反应液中每增加反应液中每增加1%1%的甲酰胺的甲酰胺浓度，浓度，TmTm值可降低值可降低0.720.72℃℃。。高盐可降低高...