细胞培养的基本知识、细胞培养的基本知识、基本技术基本技术医学院中心实验室谷景义主要内容：•1、细胞培养基本知识•2、培养细胞生长的条件•3、细胞培养的基本技术一、一、细胞培养细胞培养•把取得的组织用机械或消化的方法分散成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。培养细胞的特性培养细胞的特性1-1-生长方式及类型生长方式及类型•贴附型、悬浮型培养细胞的特性培养细胞的特性2-2-增殖特点增殖特点•体外培养的细胞既保持了一定的体内细胞的基本特性，但也具有本身的一些特点。•贴附-伸展•接触抑制-增殖的密度抑制贴附贴附--伸展伸展接触抑制•当一个细胞被其他细胞围绕导致无处可去而保持接触时，细胞不再移动，在接触区域的细胞膜活动将停止。•因此，一般正常细胞并不相互重叠于其上生长。细胞增殖密度抑制•当细胞生长汇合形成单层时，细胞变得比较拥挤，这时其分裂停止，这种细胞可在静止状态下维持存活一段时间，但不会继续分裂生殖。•转化细胞或恶性肿瘤细胞与正常细胞不同，他们的接触抑制和增殖密度抑制常常降低，因而可以增殖至较高的终末细胞密度。培养细胞的特性培养细胞的特性3-3-生长过程生长过程•单个细胞增殖：细胞周期细胞周期•高等生物体，细胞周期时间的长短变化主要集中在G1期，S，G2和M期基本保持稳定。•Hela8-16h5-9h2-8h20-28h一群细胞的增殖：细胞生长曲线•接种后，每天进行检测计数，以细胞数为纵坐标，以时间为横坐标，绘制成曲线。•测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。•饱和密度：在特定条件下，培养器皿内能达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞群体停止繁殖。•潜伏期/滞留期•指数增长期•平台期/停滞期•退化或死亡•细胞系的生长过程细胞系的生长过程•细胞系：细胞系：原代培养细胞经首次传代成功后即成为原代培养细胞经首次传代成功后即成为细胞系，可泛指一般可以传代的细胞。细胞系，可泛指一般可以传代的细胞。•细胞株：细胞株：通过筛选或克隆化，通过筛选或克隆化，从原代细胞或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的细胞。•细胞系亚系：细胞系亚系：由某一细胞系分离出来，在性状由某一细胞系分离出来，在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系•有限细胞系：如果不能继续传代或传代有限，可称为有限细胞系。•连续细胞系：能够连续传代的细胞叫做“连续细胞系或无限细胞系。可培养50代以上并无限培养下去。•大多数的二倍体细胞为有限细胞系。无限细胞系大多已发生变异。•原代细胞：原代细胞：从机体取得组织材料，在体外培养生长，到第一次传代前。•传代细胞：当原代细胞持续生长繁殖一段时间，达到一定的细胞密度后传代的细胞。培养瓶培养法培养瓶培养法方法：将培养对象直接接种于培养瓶内，再放入培养箱进行培养。优点：1、可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物的影响。2、可以方便地进行显微镜观察、染色等操作，以及永久保存。3、增加了培养瓶的培养面积。培养板培养法培养板培养法方法：将培养细胞接种在培养板的孔内，然后在CO2培养箱内培养。应培养量较小也称为微量培养。悬滴培养法悬滴培养法也称植块悬滴培养法，是最早建立的体外培养技术基本要点：将组织或器官植块接种在一张盖玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及营养液悬挂在盖玻片下，再放置于一凹形载片之上，最后用溶蜡密封后放入培养箱中培养。•1907年-Harrison用细胞培养解决一个难题•盖玻片覆盖凹型载玻片悬滴培养法悬滴培养法基本步骤1、在盖玻片上滴加胚胎提取液、血浆和植块，混匀。培养基凝固后将植块包埋。2、在凹载片周围涂凡士林。将凹载片向下压向盖玻片3、将凹载片反转，盖玻片周围涂溶蜡。放入培养箱培养•1910至1923年–Carrel和早期的组织培养•卡氏瓶培养法•1943年Earle、Dulbecco等创建单层细胞培养法，首建长期传代的L-细胞系。•1951年Gey首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。•从50年代末开始，组织培养技术应用进入了一个...
