木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及其生物学研究综述及实验方法13生物技术第二大组第二小组组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、研究背景：在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿色健康的生活也成为大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。二、木瓜蛋白酶基本介绍：木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。。另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）溶菌酶，分子量25000，约占可溶性蛋白质的20%；及纤维素酶等不同的酶。因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用，是一类巯基蛋白酶,广泛地存在于番木瓜的茎叶和果实中,未成熟的乳汁中含量最高.因其含量高、稳定性好、蛋白水解能力强,对多种蛋白质均具有很好的降解作用,目前已被广泛应用于各个行业.在食品中,木瓜蛋白酶被用于肉类嫩化、啤酒澄清和鱼类加工等工艺中.由于此酶为纯天然产物,其开发前景广阔.运用蛋白质分离纯化的一般方法可将其制备出来并进行活力鉴定。三、木瓜蛋白酶的提取1、过去的常规提取方法（1）、烘干法：在番木瓜浆液中加入保护剂，然后将浆液离心，取上清液放置于鼓风干燥箱中，在55～60℃烘干，粉碎后即得到粗酶制品。乙引等用这种方法所获得的酶得率为23.1%，但此法不利于酶活的保持，其酶活力仅为0.16×105U/g，且产品的纯度较低。（2）单宁沉淀法：乙引等用单宁沉淀法提取了木瓜蛋白酶。先将番木瓜乳汁离心，于上清液中缓慢加入已溶解的单宁溶液，不断搅拌，使溶液中单宁达到一定浓度。静置，沉淀单宁-酶复合物，调节pH值，沉淀后进行真空干燥，得到酶制品。结果表明，这种方法生产的酶得率较低，仅有7.3%，但酶活力较高，为3.53×105U/g。但是这种方法存在环境污染等问题。2、目前较为常见的提取方法（1）、超滤法：谭晶等用超滤技术分离木瓜蛋白酶。先将中空纤维超滤膜洗净，经过处理后，控制一定压力和流量，进行超滤。木瓜蛋白酶是大分子物质，在超滤过程中被截留，而水及小分子杂质透过膜，从而达到分离和纯化的目的。实验结果表明，超滤后木瓜蛋白酶的活力是超滤前的1.22倍，蛋白质含量为超滤前的2.8倍，说明超滤后木瓜蛋白酶的纯度有所增加。但由于木瓜蛋白酶属于大分子物质，在超滤过程中会在膜表面聚积而产生浓差极化现象，使超滤速率逐渐下降影响酶得率。（2）、盐析法：王丽彬等曾用硫酸铵沉淀法分离木瓜蛋白酶。在粗酶液中加入一定浓度的硫酸铵溶液...
