上课：课题3--血红蛋白的提取和分离VIP免费

蛋白质(protein)是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸(Aminoacid)按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。蛋白质的重要性血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要成分，负责运输O2和CO2课题3血红蛋白的提取和分离一、基础知识（一）蛋白质提取和分离的原理（二）蛋白质提取和分离的方法1、凝胶色谱法（分配色谱法）2、电泳法（三）缓冲溶液二、实验操作——蛋白质的提取和分离根据蛋白质的物理化学性质差异：1.分子的形状、大小2.电荷性质和多少3.溶解度4.吸附性质5.对其他分子亲和力（一）思考：蛋白质的种类多种多样，进行蛋白质提取与分离的原理是什么？1、凝胶色谱法（分配色谱法）小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢；大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快。凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。根据分离蛋白质的方法。（1）概念：（2）材料：（3）原理：（二）蛋白质提取和分离的方法相对分子质量的大小洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子2、电泳法（2）原理：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。（1）电泳：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。（二）蛋白质提取和分离的方法电泳原理示意图思考：影响蛋白质分子运动速度的因素决定运动方向电场作用力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√√√√（3）常见电泳方法有哪些？琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳（4）实例通常使用：十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量。①应用（三）缓冲溶液抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成，如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。1、作用：2、配制：二、实验操作－－实验步骤1.洗涤红细胞2.释放血红蛋白3.分离血红蛋白透析样品处理纯化纯度鉴定粗分离凝胶色谱法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳谱法血液血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个a－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团血液的组成二、实验操作－－实验步骤1.洗涤红细胞2.释放血红蛋白3.分离血红蛋白样品处理1.洗涤红细胞阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色2.释放血红蛋白阅读思考：1.释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？作用是什么？2.搅拌的目的是什么？分析：1.蒸馏水的作用是______________________________。2.加入甲苯的作用是____________________________。3.充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂滤纸过滤脂类物质3.分离血红蛋白红细胞混合液高速离心10min烧杯有机溶剂血红蛋白分液漏斗20mmol/L磷酸缓冲液4.透析透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除样品中的分子较小的杂质。纯化－－凝胶色谱法1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：3.样品的加入和洗脱教材P68图5-19注意：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。思考：你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀，无气泡？扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱...