液相色谱和毛细管电泳中的衍生试剂•为什么衍生•衍生方式•衍生试剂的构成与要求•衍生试剂种类及应用液相色谱和毛细管电泳中的衍生试剂为什么衍生•检测方法与检测信号•化学衍生主要是用于改善检测灵敏度•不好线性检测或较窄线性范围检测和高检出限的分析物，通过衍生得到改善•不能与其它基体物质分辨的分析物，通过衍生可以扩大差别•荧光生成（fluorogenic）试剂和荧光标记（fluorescentlabel）试剂.衍生反应方式•柱前衍生（pre-columnderivatizations）•柱后衍生（post-columnderivatizations)•柱中衍生（oncolumnderivatizations)•离线（offline)柱前衍生•在线（online)柱前衍生，•离线（offline)柱后衍生•在线柱后衍生柱前衍生•自由性大•衍生与柱分离的流动相无关•提高检测灵敏度•改善分离方法选择性和色谱分辨率•易于优化反应条件衍生物稳定产率高副反应产物少•选择易与色谱流动相混合的溶剂作为衍生溶剂在线柱后衍生•柱后反应器•衍生反应不强调生成单一的稳定的衍生产物•过量的衍生试剂干扰检测•要求快速并允许现时检测•加泵供给衍生试剂•反应溶剂必须与分离用的流动相易混溶•衍生试剂与柱淋洗液有效混合柱中衍生•这一衍生方法基本是把衍生试剂溶入流动相，注射样品后，在柱上分析物与流动相中的衍生试剂反应•方法适于不太稳定的衍生物，反应要快•所需衍生试剂量较大，昂贵的衍生试剂不应采用此法.衍生试剂的构成与要求•衍生试剂必须含有可检测的基团，即显色团（chromophore）、荧光团（fluorophore）和电基团（electrophore）•含有反应基团如FITCNSCH3OCH3ONCSNOOCOOHOOOCH2COO•衍生试剂稳定要纯，不含杂质，•形成一种衍生物，尽可能没有副产物形成•尽可能高衍生物产率；•需衍生试剂尽少，避免试剂峰的干扰.•对于柱后衍生试剂，同样须具有的共同条件外，应：（1）试剂与被分析物反应迅速；（2）衍生试剂转化率高，过量少，以免干扰衍生物的检测.进展文献邓樱花，王红，张华山，高效液相色谱和毛细管电泳分离荧光检测小分子氨基生物物质的进展，分析科学学报，2010，26（1）：103衍生试剂种类与应用•胺的衍生试剂•巯基的衍生试剂•羟基的衍生试剂•羰基化合物的衍生试剂•羧酸的衍生试剂•分离对映体的手性衍生试剂被衍生的氨基化合物•氨基酸•神经递质氨基酸谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)、β-丙氨酸(β-Ala)、牛磺酸(Tau)等•神经递质多巴胺、肾上腺素、去甲基肾上腺素•小肽和肽段二甘肽，三甘肽，谷胱甘肽，脑啡肽等•磷酸化氨基酸磷酸化丝氨酸(P-Ser)、磷酸化苏氨酸(P-Thr)和磷酸化酪氨酸•脂肪胺•生物胺腐胺、尸胺、精胺、亚精胺•蛋白质胺的衍生试剂•芳香邻二醛类•异硫氰酸酯类•酰氯类羰酰氯类磺酰氯•活性卤类•N-羟基琥珀酰亚胺活性酯类•其它芳香邻二醛类•OPA、2，3-萘二醛（NDA）、3-（2-呋喃甲酰基）-喹啉-2-羰醛（FQCA）、3-（4-羧基苯甲酰基）-喹啉-2-羰醛（CBQCA）.CHOCONCOOHCHOCHOCHOCHOCHOCHORNH21RSH2NSR2R1++CHOCHOCN-RNH2NCNR++CHOCONCOOH-CNNCOOHCNNR++NH2RFig.1-2.Typicalelectropherogramofa500nLaliquotofderivatizedmicrodialysatefromtheratstriatum.Theseparationbufferwas75mMboratebuffer(pH9.2)containing70mMSDSand10mMHP-β-CD.ISwascysteicacid.He-Cd激光器Electrophoresis2003,24,3187–31962,3-萘二醛(NDA)衍生CE-LIF分离检测活体中的GABA、Glu、L-Asp检测限:0.6-3nM.异硫氰酸酯类•苯异硫氰酸酯（PITC）COOHCHRNH2NCSNHCNHSCOOHRCHNNHCHOSPITCPTC-氨基酸PTH－氨基酸•Edman试剂•紫外检测254nm•衍生物稳定，分析时间也较短•副产物、溶剂等多种干扰因素可通过高效蒸发除去,较烦琐•30min内分离20余种氨基酸NNNNCS2()CH34-N，N-对二甲胺基偶氮苯-4ˊ-异硫氰酸酯（DABITC）NSCH3OCH3ONCS4-（5，6-二甲氧基苯并噻唑）苯异硫氰酸酯荧光素异硫氰酸酯（FITC）J.Chromatogr.B,2001,758,277-282Fig.1-1.Electropherogramofstandardaminoacids(eachaminoacidsconcentration:2.5×10-8M).(1)Arg,(2)Lys,(3)Gln(4)GABA,(5)Ala,(6)Gly,(7)Glu,(8)Asp,(a)FITC,(b)deco...
