血红蛋白的提取和分离-学案VIP免费

§5.3《血红蛋白的提取和分离》导学案班级：高二（）班姓名：【学习目标】1.概述凝胶色谱法、电泳法分离大分子的基本原理。2.知道缓冲溶液的作用。3.尝试对血液中血红蛋白进行提取和分离,体验从复杂体系中提取生物大分子的基础过程和方法。4.掌握对样品的预处理、色谱柱制作及装填等操作,进行样品的加入和洗脱并最终分离出血红蛋白。【自主学习】一、基础知识1.蛋白质的分离依据:蛋白质特性的差异,如分子的形状和_____、所带_____的性质和多少、溶解度、_________和对其他分子的亲和力等。2.凝胶色谱法:(1)概念:也称做___________,是根据____________________分离蛋白质的有效方法。(2)凝胶的特点形态:微小的_________组成:大多数由_____________构成结构:内部有许多___________(3)常用凝胶:_______和琼脂糖。(4)分离原理。①相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程_____,移动速度_____,通过凝胶的时间_____。②相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶_____移动,路程_____,移动速度_____,通过凝胶的时间_____。3.缓冲溶液:(1)作用:在一定范围内,缓冲溶液能够抵制______________对溶液pH的影响,维持pH基本不变。(2)配制:通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的_________就可以制得____________________的缓冲液。(3)意义:为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程,保持_____________与体内环境中的pH基本一致。4.电泳:(1)概念:带电粒子在_____的作用下发生_____的过程。(2)原理。①带电粒子:许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有_______的基团,在一定的pH下,这些基团会带上___________。②迁移动力与方向:在电场的作用下,带电分子会向着与其_____________的电极移动。③分离依据:电泳利用了待分离样品中各种分子________________以及分子本身的_____、_____的不同,使带电分子产生_______________,从而实现样品中各种分子的分离。(3)常用的电泳方法:___________电泳和________________电泳。二、实验操作第1页共4页1.样品处理:(1)红细胞的洗涤。①目的:去除_______。②方法:_______________。③标准:直至上清液不再呈现_____。(2)血红蛋白的释放。(3)分离血红蛋白溶液。①方法:混合液分层。②分层结果(自上而下):第1层:无色透明的_______。第2层:脂溶性物质的_______——白色薄层固体。第3层:_________的水溶液——_____透明液体。第4层:其他杂质的暗红色沉淀物。③结果处理:将试管中的液体用_____过滤,除去_______沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后,分出下层的_________液体。2.透析——粗分离:(1)过程:取1mL的_________溶液装入_______中,将其放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的____________中(pH为7.0),透析_____h。(2)原理:透析袋能使_______自由进出,而将_______保留在袋内。(3)目的:去除样品中_________________的杂质。3.凝胶色谱操作——纯化:(1)凝胶色谱柱的制作↓(2)凝胶色谱柱的装填:凝胶用_______充分溶胀后,配成凝胶悬浮液,_______缓慢倒入凝胶色谱柱内↓①加样前：打开流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面_____，关闭出口②加样：用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的_____，注意不要破坏凝胶面③加样后：打开下端出口，使样品渗入_______内↓(4)洗脱:_____下端出口,加入磷酸缓冲液,连接______________,_____下端出口,进行洗脱4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳——纯度鉴定:判断纯化的蛋白质是否达到要求,需要进行___________的鉴定。鉴定方法中,使用最多的是________________________。第2页共4页(3)样品的加入三、操作提示1.红细胞的洗涤:_________、离心速度与_________十分重要。洗涤次数过少,无法除去_____蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀,达不到分离的效果。2.色谱柱填料的处理:商品凝胶使用前需直接放在_______中膨胀,可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热,加速膨胀。3.凝胶色谱柱的装填:在装填凝胶柱时,不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的_________,降低_________。4.蛋白质的分离:如果红色区带__________________,说明色谱柱制作成功。【预习小测】1....