AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒上海优宁维生物科技有限公司一、概述在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。碘化丙啶（PropidiumIodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。因此，将AnnexinV与PI联合使用时，PI则被排除在活细胞（AnnexinV-/PI-）和早期凋亡细胞（AnnexinV+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC和PI结合染色呈现双阳性（AnnexinV+/PI+）。图AnnexinV检测细胞凋亡原理二、试剂盒组份产品编号产品名称规格556547AnnexinV-FITCApoptosisDetectionKitI100testsComponents556547aAnnexinVBindingBuffer,10Xconc(51-66121E)556547bAnnexinV-FITC(51-65874X)三、实验步骤贴壁细胞需用0.25%的胰酶消化。注意过度消化可损伤细胞。在消化时可加2％的BSA可防止消化过度。如果用含EDTA的胰酶消化时，注意必须彻底清除EDTA：在标记前用1×PBS或1×bindingbuffer洗涤，清除EDTA，以免残余的EDTA与Ca2＋螯合，影响AnnexinV的结合。（1）用去离子水将10×BindingBuffer稀释成1×BindingBuffer；（2）细胞收集。悬浮细胞收集：离心5分钟；贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化收集后（注：胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与AnnexinV-FITC的结合），于室温2000rpm离心5～10分钟，收集细胞；（3）细胞洗涤：用预冷1×PBS（4℃）重悬细胞一次，2000rpm离心5～10分钟，洗涤细胞；（4）加入300μL的1×BindingBuffer悬浮细胞；（5）AnnexinV-FITC标记：加入5μL的AnnexinV-FITC混匀后，避光，室温孵育15分钟；（6）PI标记：上机前5分钟再加入5μL的PI染色。（7）上机前，补加200μL的1×BindingBuffer。四、保存：4℃保存；避免反复冻融。五、注意事项（1）本试剂只适用于实验，不适用于临床检测；（2）PI（propidiumiodide，碘化丙锭）有毒性，能通过皮肤吸收，对眼睛有刺激作用，使用时需戴手套；（3）AnnexinV-FITC和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。在处理和标记时，尽可能在暗处进行。在孵育阶段，用铝箔包裹容器或置于抽屉中。细胞标记后，在暗室内用显微镜观察；（4）整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作，以免影响细胞状态。（5）在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果。（6）为防止荧光衰变，宜在1小时内进行流式检测。（7）PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行AnnexinV-FITC染色，最短可在上机前5分钟再加入PI染色。、其他AnnexinV系列产品清单：产品编号产品名称规格556547ANXNVFITCAPOPTOSISDTECKITI100tests559763ANXNVPEAPOPTOSISDTECKITI100tests556420ANNEXINVRECOMFITC100tests556422ANNEXINVRECOMPE100tests556419ANNEXINVRECOMFITC200tests556421ANNEXINVRECOMPE200tests550911ANXNV-FITCFLUORESCENCEMICROSCOPYKIT25tests556463PropidiumIodideStainingSolution2ml5599257-AADStainingSolution2ml…….邮箱：info@univ-bio.com<4008-168-068>
