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聚丙烯酰胺凝胶电泳前活性染料与蛋白质共价染色的条件探索VIP免费

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第38卷2010年10月分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告ChineseJoumMofAnalyticalChemistry第10期1423—1427DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.01423聚丙烯酰胺凝胶电泳前活性染料与蛋白质共价染色的条件探索戴彬1吉坤美2张同艳1彭孝军“1(大连理工大学精细化工国家重点实验室,大连116012)2(深圳大学医学院,深圳518960)摘要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳前染色法,考察了多种类型活性染料与牛血清白蛋白共价染色的条件。实验发现,活性蓝KN·R型标记效果最佳,其优化标记条件为:pH10.0,60℃,50min,蛋白检出限达200ng,重复性和测试范围内的定量性较好,可在电泳时直接实时观测,作为蛋白标示剂有一定的应用前景。关键词聚丙烯酰胺凝胶电泳;蛋白染色;活性染料1引言采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法对蛋白质等样品进行分离¨J,一般需要对分离样品进行染色,以检验分离效果,这主要是利用染料和生物大分子(如蛋白质等)结合生成有色的复合物来实现检测的目的。目前,比较常见的染色方法有后染色法和前染色法。后染色法是在电泳之后进行蛋白质染色的方法,考马斯亮蓝染色和银染法就是最为常见的两种蛋白电泳后染色法【2J。人们尝试用荧光染料对凝胶中的蛋白质条带进行染色旧,4J,但这种方法需要在uV瞬变显示器或紫外灯下观测,不能实时观察分离过程。后染色法需要在电泳之后再进行一步染色操作,耗时。前染色法,即预染色法,是在电泳前对蛋白质染色的一种方法。前染色法操作简单方便,而且可在电泳同时实时观察蛋白质的电泳分离带。本研究比较了几组商品化活性染料的蛋白质染色条件,可用肉眼直接观测分离过程。活性染料廉价易得,对用作蛋白标示剂p·具有一定的意义。2实验部分2.1仪器与试剂DYY-8C型电泳仪(北京市六一仪器厂);TGL-16高速台式冷冻离心机(湘仪离心机);GTS-2010型全自动数码凝胶图像处理系统。X型活性染料:艳蓝X.BR、嫩黄X-6G、橙X.GN、艳红X-3B;KN型活性染料:艳蓝KN.R、翠蓝KN—G、艳紫KN·B;M型活性染料:深蓝M-2GE、艳红M-8B、翠蓝M—GB、红M-2BE、深蓝M—BE,均为商业染料,购自泰兴市锦鸡染料有限公司。牛血清白蛋白(BSA,纯度>198%,北京奥博星生物技术有限责任公司);丙烯酰胺、Ⅳ,J7\r’一甲叉双丙烯酰胺、riffs缓冲溶液、过硫酸铵(APS)、四甲基二乙胺(TEMED)、甘氨酸、硼酸、硼砂、乙醇、冰醋酸、考马斯亮蓝G250,均为化学纯试剂。实验用水为二次蒸馏水。2.2实验过程将活性染料与牛血清白蛋白在样品缓冲液中混合,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法对不同染料与蛋白染色的时间(10~90min)、温度(40一80℃)和pH值(8.18—10.0)等进行考察,并对结果进行优化。蛋白标记结果以整合密度值(Integrateddensityvalue,IDV)半定量分析表示【6],IDV值通过GTS-2010软件计算得出。选用10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(分离胶10%,浓缩胶5%【71),电泳时设置初始电压约为70~80V,初始电流约为40—50mA,0.5h后升高电压至100—110V,电泳时间约2h。电泳后直接观测,需用考马斯亮蓝溶液进行染色,操作参考文献[7]进行。2010旬1—19收稿;20104)4.10接受本文系国家自然科学基金(No.20725621)资助项目·E-mail:daibmdlm@yahoo.t?,om.cn万方数据1424分析化学第38卷3结果与讨论3.1反应原理活性染料分子结构主要包括染料母体和活性基团两大部分。按活性基团不同,常见的活性染料可分为:二氯均三嗪型(X型)、一氯均三嗪型(K型)、乙烯砜型(KN型)、一氯均三嗪与JB一乙烯砜硫酸酯基复合型(M型)和双一氯均三嗪型(KE/KD型)。由于K型染料分子中只有一个活泼氯原子,所以反应活性低,通常要在较高温度(90℃以上)的条件进行染色;而KE/KD型染料的反应活性与K型相似【sJ,本研究中只选取X型、KN型和M型染料进行蛋白质标记。通常活性染料对蛋白质纤维(丝绸、羊毛)染色的化学反应原理如图1。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质之一,能够与类别广泛的内源物质(如代谢产物等)和外源物质(如药物等)进行可逆性的非共价结合,从而发挥其贮存、转运以及机体保护等重要的生理功能。相对于其它生物大分子而言,血清白蛋白(Serumalbumin,SA)来源广泛,尤其是人血清白蛋白(Humanseruma...

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