聚丙烯酰胺凝胶电泳前活性染料与蛋白质共价染色的条件探索VIP免费

第38卷2010年10月分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告ChineseJoumMofAnalyticalChemistry第10期1423—1427DOI：10．3724／SP．J．1096．2010．01423聚丙烯酰胺凝胶电泳前活性染料与蛋白质共价染色的条件探索戴彬1吉坤美2张同艳1彭孝军“1(大连理工大学精细化工国家重点实验室，大连116012)2(深圳大学医学院，深圳518960)摘要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳前染色法，考察了多种类型活性染料与牛血清白蛋白共价染色的条件。实验发现，活性蓝KN·R型标记效果最佳，其优化标记条件为：pH10．0，60℃，50min，蛋白检出限达200ng，重复性和测试范围内的定量性较好，可在电泳时直接实时观测，作为蛋白标示剂有一定的应用前景。关键词聚丙烯酰胺凝胶电泳；蛋白染色；活性染料1引言采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法对蛋白质等样品进行分离¨J，一般需要对分离样品进行染色，以检验分离效果，这主要是利用染料和生物大分子(如蛋白质等)结合生成有色的复合物来实现检测的目的。目前，比较常见的染色方法有后染色法和前染色法。后染色法是在电泳之后进行蛋白质染色的方法，考马斯亮蓝染色和银染法就是最为常见的两种蛋白电泳后染色法【2J。人们尝试用荧光染料对凝胶中的蛋白质条带进行染色旧，4J，但这种方法需要在uV瞬变显示器或紫外灯下观测，不能实时观察分离过程。后染色法需要在电泳之后再进行一步染色操作，耗时。前染色法，即预染色法，是在电泳前对蛋白质染色的一种方法。前染色法操作简单方便，而且可在电泳同时实时观察蛋白质的电泳分离带。本研究比较了几组商品化活性染料的蛋白质染色条件，可用肉眼直接观测分离过程。活性染料廉价易得，对用作蛋白标示剂p·具有一定的意义。2实验部分2．1仪器与试剂DYY-8C型电泳仪(北京市六一仪器厂)；TGL-16高速台式冷冻离心机(湘仪离心机)；GTS-2010型全自动数码凝胶图像处理系统。X型活性染料：艳蓝X．BR、嫩黄X-6G、橙X．GN、艳红X-3B；KN型活性染料：艳蓝KN．R、翠蓝KN—G、艳紫KN·B；M型活性染料：深蓝M-2GE、艳红M-8B、翠蓝M—GB、红M-2BE、深蓝M—BE，均为商业染料，购自泰兴市锦鸡染料有限公司。牛血清白蛋白(BSA，纯度>198％，北京奥博星生物技术有限责任公司)；丙烯酰胺、Ⅳ，J7＼r’一甲叉双丙烯酰胺、riffs缓冲溶液、过硫酸铵(APS)、四甲基二乙胺(TEMED)、甘氨酸、硼酸、硼砂、乙醇、冰醋酸、考马斯亮蓝G250，均为化学纯试剂。实验用水为二次蒸馏水。2．2实验过程将活性染料与牛血清白蛋白在样品缓冲液中混合，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法对不同染料与蛋白染色的时间(10～90min)、温度(40一80℃)和pH值(8．18—10．0)等进行考察，并对结果进行优化。蛋白标记结果以整合密度值(Integrateddensityvalue，IDV)半定量分析表示【6]，IDV值通过GTS-2010软件计算得出。选用10％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(分离胶10％，浓缩胶5％【71)，电泳时设置初始电压约为70～80V，初始电流约为40—50mA，0．5h后升高电压至100—110V，电泳时间约2h。电泳后直接观测，需用考马斯亮蓝溶液进行染色，操作参考文献[7]进行。2010旬1—19收稿；20104)4．10接受本文系国家自然科学基金(No．20725621)资助项目·E-mail：daibmdlm@yahoo．t?,om．cn万方数据1424分析化学第38卷3结果与讨论3．1反应原理活性染料分子结构主要包括染料母体和活性基团两大部分。按活性基团不同，常见的活性染料可分为：二氯均三嗪型(X型)、一氯均三嗪型(K型)、乙烯砜型(KN型)、一氯均三嗪与JB一乙烯砜硫酸酯基复合型(M型)和双一氯均三嗪型(KE／KD型)。由于K型染料分子中只有一个活泼氯原子，所以反应活性低，通常要在较高温度(90℃以上)的条件进行染色；而KE／KD型染料的反应活性与K型相似【sJ，本研究中只选取X型、KN型和M型染料进行蛋白质标记。通常活性染料对蛋白质纤维(丝绸、羊毛)染色的化学反应原理如图1。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质之一，能够与类别广泛的内源物质(如代谢产物等)和外源物质(如药物等)进行可逆性的非共价结合，从而发挥其贮存、转运以及机体保护等重要的生理功能。相对于其它生物大分子而言，血清白蛋白(Serumalbumin，SA)来源广泛，尤其是人血清白蛋白(Humanseruma...