伏马菌素B1间接竞争ELISA检测方法的建立和应用VIP免费

--——278---——江苏农业科学2007年第6期伏马菌素B1间接竞争ELISA检测方法的建立和应用陈飞，邵景东(江苏省张家港出入境检验检疫局，江苏苏州215000)摘要：以人工合成的抗原OVA—FB1作为包被抗原，FB1(伏马菌素B1)为竞争抗原，两者与一定量的抗FB1单抗反应，建立检测FB1的间接竞争ELISA方法，对玉米样品进行初步检测应用。结果表明，间接竞争ELISA方法最佳抗原包被浓度为196ng／ml，包被时间为4℃过夜，单抗最佳工作浓度为1：4000，酶标二抗最佳工作浓度为1：2500，最佳的抗原抗体竞争反应时间和温度为4℃过夜作用。可测最适范围为10～1000ng／ml。回归方程为Y=1．113—0．313x，相关系数R为一0．990，灵敏度为90．88ng／nl，最低检测限为7．83ng／ml，批内和批间变异系数分别为3．24％和2．45％，平均添加回收率为94．32％。关键词：伏马菌素B1；间接竞争ELISA；检测中图分类号：$852．4文献标识码：A文章编号：1002—1302(2007)06—0278—04伏马菌素是一类主要由串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)污染玉米等粮谷类(包括由其加工生产的食品和饲料)所产生的真菌毒素，目前共有11种，广泛存在于玉米及其制品中，在大米、小麦、大麦、调味品、高粱、啤酒、牛奶等食品和饲料中也有一定浓度的存在¨。FB1是伏马菌素的主要组成成分，也是导致伏马菌素产生毒性作用的主要因素，不仅可以引起马脑白质软化症和猪的肺水肿综合症，对其他多种动物造成毒性作用及诱发肿瘤，还与人类食管癌的发生有着非常密切的关系J。国际癌症研究中心(internationalagencyforresearchoncancer，IARC)把它划分到2B组，即人类可能的致癌物，在畜牧业和人类健康上意义重大，正越来越受到人们的重视。目前，玉米在我国大部分地区仍是人的食物和动物饲料的主要来源，因此迫切须要测定和调查玉米等粮食及其制品中伏马菌素的含量，并根据我国国情对伏马菌素进行风险性评估，制定食品、饲料中限量标准和人体每日最大耐受量。目前，我国尚未建立检测食品及饲料中伏马菌素的国家标准方法。测定粮谷类食品和饲料中FB1的方法主要有薄层色谱法(TLC)J、液相色谱法收稿日期：2007—06—06基金项目：江苏出入境检验检疫局科研项目(编号：2004KJ01)。作者简介：陈飞(1972～)，男，江苏射阳人，主要从事动物及其产品出入境检验检疫工作。Tel：(0512)58386791；E—mail：bainui@126．corn。(LC)和免疫学方法等。这些方法中，TLC法灵敏度低，而且是目测半定量检验，结果易受主观因素影响，操作过程中容易接触到FB1标准品而影响操作者的健康，因此其应用受到限制。LC法虽然灵敏度较高，结果稳定，但所需仪器设备昂贵，对操作者的技术要求高，也不适用于大批样品的筛选，更不适宜在基层和现场应用。与此同时，以ELISA为基础的免疫学检测方法具有快速、简便、灵敏、经济的特点，适用于大批样品的筛查，越来越受到人们的青睐和重视，国外已经有商品化的FB1ELISA检测试剂盒，但是价格非常贵J。因此，我们在获得的抗FB1特异性单克隆抗体的基础上，建立了检测FB1间接竞争ELISA方法，并对其线性检测范围、灵敏度、检测限、精确度、回收率、稳定性等参数进行了研究，利用该方法对部分企业饲料用玉米进行了初步检测，为最终形成商品化的试剂盒奠定了很好的基础。1材料与方法1．1材料1．1．1实验动物及细胞系8周龄雌性Balb／c小鼠由扬州大学比较医学中心提供；分泌抗FB1特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞由扬州大学兽医学院动物预防医学实验室研制并保存。1．1．2主要试剂FB1标准品、HRP标记羊抗鼠IgG购自Sigma公司；包被抗原OVA—FB1，由载体蛋白OVA与半抗原FB1通过戊二醛一步法偶联而成，由扬州大学兽医学院动物预防医学实验室提供；维普资讯http://www.cqvip.com陈飞等：伏马菌素B1间接竞争ELISA检测方法的建立和应用一279一OPD购自上海生物工程有限公司；卵清蛋白OVA购自上海伯奥生物科技有限公司，其他相关试剂均为国产分析纯。1．2方法1．2．1单抗的制备和纯化取8～10周龄Balb／e小鼠，腹腔注射液体石蜡0．5ml，7d后腹腔注射5×10个杂交瘤细胞，接种5d后每天观察小鼠腹水产生情况。当腹腔明显鼓起，并且皮肤有紧张感时，用16号针头采集腹水2...