实验九、等电聚焦电泳VIP专享VIP免费

实验九聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点一、目的要求1.学习和掌握圆盘电泳技术2.学习和掌握等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点方法二、原理聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(IsoelectricFocusing-PAGE，简称IEF-PAGE)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrierampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。两性电解质载体(carrierampholytes)(1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。(2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。(3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。(4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。IEF-PAGE分离蛋白质并测定pI图3.6聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3三、试剂与器材试剂：两性电解质载体pH3-10、10%四甲基乙二胺、10%过硫酸铵、5%H3PO4、2%NaOH、40%蔗糖、0.04％考马斯亮兰R250、7%醋酸器材：圆盘电泳槽、稳压稳流电泳仪、脱色摇床四、操作方法1.凝胶柱的制备（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中(与橡皮接触的部分凝胶不易聚合，可在橡皮帽中先加一滴40%的蔗糖)（2）配胶表10mL7.5%凝胶的配制试剂名称体积(mL)凝胶贮液2.5两性电解质载体0.510%TEMED0.1蛋白质混合样品0.1蒸馏水6.75混匀后置真空干燥器中抽气10min10%过硫酸铵0.05（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，至离上端1cm处，再用注射器缓缓加水3-5mm高。（4）待凝胶聚合2.电泳小心地拔出玻管，并用蒸馏水洗去蔗糖溶液，把管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中加入5%磷酸缓冲液，在下槽中装入2%氢氧化钠溶液。避免管下有气泡。上槽接电泳仪的正极，下槽接负极，打开电源，先调电压至100V，待电压稳定后再升到300V，电泳2h以上至电流降为0，将电压调至0，关闭电源。3．剥胶电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水充分洗净两端电极液，在凝胶条的正极端插一铜丝为标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出。4.固定染色取其中一条凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝胶条长度。放入染色液中同时进行固定染色1-2h，用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端的距离。5.pH梯度的制作取另一条凝胶条放在玻板上，从凝胶的正极端开始，每隔0.5cm切下一段，依次放入已编好号并装有1mL蒸馏水的试管中，浸泡过夜。次日用酸度计分别测定每管浸提液的pH值。以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标，绘制标准pH梯度曲线。6.蛋白质样品等电点的计算求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：固定后的蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离固定染色前凝胶条长度固定染色后凝胶条长度计算出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度后，直接从pH梯度曲线上求出该蛋白质等电点。五、注意事项(1)盐离子可干扰pH梯度形成并使区带扭曲。为防止上述影响，进行IEF-PAGE时，样品应透析或用SephadexG-25脱盐，也可将样品溶解在水或低盐缓冲液中使其充分溶解，以免不溶小颗粒引起拖尾。(2)加样量则取决于样品中蛋白质的种类、数目以及检测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝R-250染色，加样量可为50-150g；如用银染色，加样量可减少到1g。一般样品浓度以0.5-3mg/mL为宜，最适当加样体积为10-30l。六、思考题(1)简述聚丙烯酰胺等电聚焦电泳的基本原理。(2)进行聚丙烯酰胺等电聚焦电泳时的注意事项有哪些？