苜蓿抗感褐斑病品种内超氧化物歧化酶、过氧化物酶和多酚氧化酶活性的比较袁庆华,桂枝,张文淑(中国农业科学院畜牧研究所,北京100094)摘要:利用离体叶接种技术分别将伊鲁瑰斯、沙河、萨兰斯和沙湾4个苜蓿品种内的植株分为抗病株和感病株,并分别接种苜蓿假盘菌,对抗、感病植物叶片中的SOD、POD及PPO的活性进行了测定。结果表明,接种前抗、感株叶片中4种酶的活性基本相同,接种后17d内酶活性先升后降,而抗病株的酶活性增加高于感病株。最后抗、感病株3种酶活性趋于一致。关键词:苜蓿;褐斑病;超氧化物歧化酶;过氧化物酶;多酚氧化酶中图分类号:S432.1文献标识码:A文章编号:100425759(2002)0220100205α大量的研究结果表明,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)及多酚氧化酶(PPO)都在植物的抗病过程中起着重要的作用[1～5]。许多研究者认为,植物体内有一组保护酶系统(SOD、POD及PPO),在未受到病菌侵染前使活性氧处于低水平的动态平衡状态;当植物受到病原菌侵染后,被侵组织的活性氧突增,而该保护酶系统具有清除活性氧,防止植物受害的作用[1,6,7]。以往对不同作物接种病菌后保护酶的活性作了大量的实验研究[1～3,7],以探讨保护酶与寄主抗病性的关系,作为筛选抗性材料的生化指标之一。但是,对于同一品种内,特别是同一牧草品种内不同抗、感植株的保护酶变化的研究尚不多见。笔者和我国其他人员[8,9]曾对苜蓿品种抗褐斑病的特性分别开展过室内与田间的特性评价。在以往工作的基础上,笔者通过离体叶接种[10],已经从同一品种内600个单株中筛选出抗病单株和感病单株(待刊)。在此基础上,通过苜蓿假盘菌的接种,对抗、感株进行保护酶活性测定,以比较抗、感株酶活性的变化动态,对离体叶接种的有效性做进一步检验,并为苜蓿抗褐斑病育种提供理论依据。1材料与方法1.1实验材料1.1.1供试品种选用4个苜蓿品种,即伊鲁瑰斯、沙河、萨兰斯和沙湾,它们的病指数分别为13.48、21.48、28.25和33.68。用离体叶接种方法[10]从每个品种600株中筛选出最抗的和最感的苜蓿单株各5株,进行无性扦插扩繁,取扩繁后的各品种抗感单株各30株,作为供试材料。1.1.2菌种与取样方法苜蓿假盘菌(Pseudopezizamedicaginis)在V-8碳酸钙琼脂培养基上培养,20℃恒温黑暗条件下培养30d,按袁庆华等[8]的方法接种病菌,分别于接种前1d,接种后2、7、12、17d对抗感单株逐株取相同部位的一个叶片,将同一抗病或感病单株的叶片放在一起,并用去离子水冲洗干净后,用于制备酶液。1.2实验方法1.2.1酶液提取称取0.5g去中脉的苜蓿叶片,放入研钵中,取5ml1�15mol磷酸缓冲液(pH=7.8)倒入研钵内,冰研磨成匀浆,6000r�min离心20min,倾出上清液,放入5ml试管内,剩余物加少量缓冲液冲洗后,再次离心(6000r�min,5min),取上清液,如此重复3次,直到酶粗提液补足5ml。将酶液放入4℃冰箱中保存备用。以上方法用于SOD、PPO酶液的提取,而POD酶液的提取使用的是0.01mol�L磷酸缓冲液(pH=7.2),其余方法同上。100-1046�2002草业学报ACTAPRATACULTURAESINICA第11卷第2期Vol.11,No.2α收稿日期:2001208207基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号39870559)。作者简介:袁庆华(19592),女,天津人,副教授。1.2.2超氧化物歧化酶活性测定SOD活性测定参照王爱国等[9]和韩雅珊[11]的方法。3ml反应液中含有:0.013mol�L甲硫氨酸、63×10-6mol�L氮蓝四唑、1.3×10-6mol�L核黄素、1×10-4mol�L乙二胺四乙酸(ED2TA)及pH=7.8的0.05mol�L磷酸缓冲液,加入稀释30倍的酶粗提液1ml,在30℃下用4000Lux荧光照射10min,并在560nm波长下测量透光率。以每克鲜重含有的酶活单位(U�gfw)表示。各样品均重复测定2次。1.2.3过氧化物酶活性测定采用愈创木酚做底物,用分光光度法测定生成物的含量。反应液中含有1ml0.1mol�L磷酸缓冲液(pH=7.2)、1ml0.1mol�L愈创木酚、1ml0.8%H2O2,并加入适量的酶液后在30℃下反应20min,并在470nm波长下测定吸光值。以1ml去离子水代替H2O2为对照。在上述反应条件下,以每分钟每克鲜重OD值变化1.00所需的酶量为一个酶活单位。各样品均重复测定2次。1.2.4多酚氧化酶活性测定在小试管中依次加入1.5ml1�15mol磷酸缓冲液(pH=6.8)、1.5ml0.02mol邻苯二酚及适量的酶粗提液混合均...
