课题3-血红蛋白的提取和分离-(8)VIP免费

课题背景蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作。((一一))蛋白质分离的原理：蛋白质分离的原理：根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。一、基础知识（二）凝胶色谱法（二）凝胶色谱法2.2.凝胶：凝胶：大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构凝胶的分子筛作用，来进行分离蛋白质的有效方法。1.1.概念：概念：（（分配色谱法分配色谱法））小蛋白质大蛋白质混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子3.3.凝胶色谱法分离蛋白质的具体过程凝胶色谱法分离蛋白质的具体过程4.4.凝胶色谱法的原理凝胶色谱法的原理①相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;②相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发生变性呢？（三）缓冲溶液（三）缓冲溶液抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。1.1.作用作用::2.2.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制::通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。3.3.在本课题中使用的缓冲液是在本课题中使用的缓冲液是::磷酸缓冲液,成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠如何鉴定凝胶色谱法分离得到的蛋白质是目的蛋白？（四）电泳：（四）电泳：1.1.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.2.原理：原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3.3.类型类型::琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质－SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电原有的电荷量荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别不同种蛋白质间的电荷差别使其迁移速度完全取决于分子的大小由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同琼脂糖凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（测定蛋白质的分子量）3.3.类型类型::聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。1.1.原理：原理：SDSSDS能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质蛋白质——SDSSDS复合物复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。2.SDS2.SDS作用机理作用机理::用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的方法使用使用SDS—SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分定...