细胞传代培养（消化法）具体操作：(?k一.传代前准备：1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。v@V-f\&5W2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。I3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。O]_]K]4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。F"¤5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。O/`uO%6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。\0{6Es7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。F+)V8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。7t二.胰蛋白酶消化；"-mm-,x1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。]\2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。+<23.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。&三.吹打分散细胞：u¤~1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。u0%)-四.分装稀释细胞：(T0`1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。2>Q§2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。五.继续培养：{t2o;e6f用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。"g3aZ@>~传代细胞培养注意事项：;{P?W1.严格的无菌操作.aSu*0G82.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。m+)C¤5d附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二钠）消化液配方：]S8s/7EDTA0.20g，NaCl8.00g，KCl0.20g，KH2PO40.02g，葡萄糖2.00g，0.5％酚红4ml，加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。§OSoW^-p细胞的复苏"T7;3kJ细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。fZ-/G:X8q具体操作b#Ok1-yU)一.实验前准备：aORUI3-y1.将水浴锅预热至37℃AJ+'lD.2.用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。(NX%|O=l93.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。#=D¤wVVu二．取出冻存管：!xo:2(-\-]1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。OU]U\V)2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。{&8;BW:"[三．迅速解冻：&9rk)!x(1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。1$]0A]/!2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。A!G四.平衡离心：%)P=Be用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min离心3minZK五.制备细胞悬液：_YUX~D{h1.吸弃上清液。$§Vt3U/A2.向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。n>六.细胞计数：&/OF9Ue细胞浓度以5×105/ml为宜。+_[@¤七.培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。a^v=/c初学者易犯错...
