·490·《生命的化学》2009年29卷3期CHEMISTRYOFLIFE2009，29(3)●RecentProgress文章编号:1000-1336(2009)04-0490-05细胞冷冻冰晶损伤和应激损伤机理袁晓华(乌鲁木齐血液中心，乌鲁木齐830000)摘要：低温下保存生物材料可使临床研究不受限于时间空间，安全有效的细胞冻存可以为组织工程、基因治疗和细胞移植提供丰富的细胞来源。冷冻保存已经成功应用于许多细胞株系，但不同来源的细胞系冻存效率差别很大，仍有细胞系在提高低温冻存效率时面临瓶颈无法突破。细胞冷冻损伤机理在冰晶损伤和细胞应激损伤方面还有待更深入的了解，本文将集中讨论近年来这方面的一些研究进展。关键词：冷冻损伤；胞内冰晶；间隙连接；调亡；热激蛋白中图分类号：Q65/Q813收稿日期：2009-02-23作者简介：袁晓华(1980-)，女，硕士，联系作者，E-mail:ynotte2@yahoo.com.cn自从1949年Polge等意外发现甘油对家禽精子的冷冻保护作用以来，人们一直在探索细胞冷冻损伤的机制，希望能够从中寻找一些复杂细胞组织未能实现低温冻存的原因并开发新的途径。一般认为在降温和升温过程中细胞内外水分的结晶程度和温度变化速率达到最佳平衡是至关重要的，通过对不同来源的细胞采取不同的冷冻保护剂配方，调节降温升温速率，最大限度地避免冰晶的生长和细胞体积过度变化，使许多株系的细胞得到成功冻存。但还有许多细胞株在提高冷冻保存效率时面临瓶颈无法突破，这体现了细胞对冷冻损伤反应的种属特异性，“耐冻”与“不耐冻”细胞株之间的区别在哪里？本文综述了近年来细胞冷冻损伤机理研究方面的一些进展。1.细胞冻存中的冰晶损伤Mazur的“两因素假说”将细胞冷冻损伤归结于“溶质损伤”和“胞内冰损伤”两大原因，人们也是从尽量避免此两种伤害来设计防冻液成分及降温速率来冻存细胞。但细胞冻存过程中细胞内外冰晶的形成机制以及其对细胞造成致命损伤的机制有待更深入的研究。在细胞降温过程中微小冰晶的形成本身不是绝对有害的，它取决于这些冰晶是否会在复温过程以微小冰晶为核，发生再结晶[1]。近年Acker等[2-5]对细胞冷冻过程中胞内外冰晶的形成机制做了一系列的研究，提出了无害胞内冰(innocuousintra-cellulariceformation)[2]。他们比较了单个培养和单层培养细胞冷冻时的胞内冰晶对细胞复苏率的影响，认为对于单个细胞，胞内冰的成核生长对细胞有害，但对于以单层细胞形式冷冻来说，胞内冰沿细胞间隙在相邻细胞的扩散是无害的，甚至部分胞内冰的形成避免了细胞过度脱水和体积骤变对细胞膜、细胞器造成的损害，具有冷冻保护作用。而胞外冰晶的形成也不是绝对无害的，如人胚胎干细胞以紧致的细胞团形式冷冻保存，胞外冰晶的形成会破坏细胞的间隙连接，造成细胞岛团松散，复苏率极低[8]。总的来说，细胞以单个细胞悬液、单层细胞还是以多层细胞团形式冻存会造成冰晶的生长模式的不同[6]；冰晶的形成不是绝对有害的，细胞冷冻降温过程中形成的胞内冰晶是否会对细胞造成致命损伤取决于冰晶的数量、大小、形成位置以及复温条件。2.细胞间隙连接对冷冻损伤的作用细胞间隙连接(gapjunction)是存在于大多数动物组织细胞之间或细胞与细胞外基质之间的一种连接结构。体外培养的哺乳动物细胞在冷冻保存时，如果以单细胞悬液的形式进行保存，细胞在加入防冻液后与之接触充分，使防冻液的渗透能够较完全，·491·《生命的化学》2009年29卷4期CHEMISTRYOFLIFE2009，29(4)●新进展细胞复苏率较高。但对于有些细胞，如人和灵长类的胚胎干细胞株系，细胞以岛团状方式生长，细胞之间存在间隙连接，紧密的细胞连接和细胞旁分泌因子对维持其体外未分化生长至关重要，所以细胞冻存时必须以含100~200个以上细胞的团块形式进行的[9,20]。这样影响了细胞与防冻液的接触，此时细胞间隙连接的存在对冰晶生长的影响可能是造成其冷冻保存效率低下的原因，这对皮肤等组织的冷冻保存研究也具有重要意义。复杂细胞组织冷冻时，胞内冰在细胞层内随机形成，然后向相邻细胞间扩散，使胞内冰的形成机率大大增加，其扩散方向不是随机的(如图1所示)[4]，这一现象广泛存在于复杂细胞组织冷冻中。后来的研究表明，细胞之间的接触和胞内冰的形成有密...
