猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立VIP免费

������������������������������������������������������������������������������������猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立职爱民左建军黄志毅邹仕庚冯定远摘要用机械刮取小肠粘膜加胶原酶Ⅱ消化的方法，采用新生未吮乳仔猪小肠组织，成功地分离了猪小肠粘膜上皮细胞（Intestinalepithelialcells,IEC）且在体外培养传代，并采用碱性磷酸酶和角蛋白免疫学试验鉴定，结果表明：体外培养的猪IEC在DMEM-F12培养基中，细胞在1~2d贴壁，5~6d形成细胞克隆，9~11d融合成片；碱性磷酸酶和生物素标记的细胞角蛋白抗体鉴定结果显示90%培养的细胞为阳性，分别从生化的角度证明和细胞生物学角度鉴定了所培养的细胞为IEC。关键词猪；小肠粘膜细胞；原代培养中图分类号S828职爱民，河南省农业科学院农业部动物免疫学重点开放实验室，博士，副研究员，450002，河南省郑州市农业路1号。左建军、黄志毅、邹仕庚、冯定远(通讯作者)，华南农业大学动物科学学院。收稿日期：2009-10-26★国家重点基础研究发展计划项目(2004CB117501)、广东联合基金项目(No.u0731004)和博士点基金项目(20070564014)资助肠粘膜上皮细胞(Intestinalepithelialcells,IEC)是肠道的重要功能细胞，参与肠道食糜的消化、吸收、免疫屏障和应激反应等，并与肠道的内、外分泌功能关系十分密切。长期以来，在研究IEC的生物学功能、细胞增殖和分化的调控因素，物质吸收与代谢等多采用肠道肿瘤细胞系为试验模型[1]。然而癌细胞是非正常的细胞，其生理特征明显不同于正常细胞，单纯由癌细胞系的研究结果来解释正常细胞的行为，明显有其不足。原代培养是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养，原代培养的细胞生物学特性变化较少，最能反映和接近体内生长特性，是一种良好的试验载体。国外早在1993年就有猪肠细胞原代培养的报道[2]，其它类型的猪组织细胞原代培养的报道也不少[3-5]，国内关于动物体细胞原代培养的报道多集中在其它动物身上[6-9]，而关于猪IEC原代培养的方法一直属于空白。本试验的目的就是通过机械和酶消化结合的方法建立猪IEC原代培养的系统，为猪肠道营养的研究提供新的试验材料。1试验材料1.1试验动物新生杜×长×大三元杂交仔猪（未吮奶），购于广东省原种猪场。1.2主要仪器设备与试剂NU-2500型CO2细胞培养箱(Nuaire公司，美国)；IX70型倒置生物显微镜(Olympus公司，日本)；5804R型高速大容量冷冻离心机(Eppendorf公司,德国)；SW-CJ-1F型超净工作台(苏州净化，中国)；HVE-50型高压蒸汽灭菌锅(HIRAYAMA公司，日本)；GF-M2000型酶标仪（山东高密彩虹仪器公司）；CS101-2AB型鼓风干燥箱(重庆试验设备厂)；79-1型磁力加热搅拌器(江苏金坛荣华仪器总厂)；Orion420A+型酸度计(ThermoElectron公司，美国)；DMEM培养基、胎牛血清、胰酶和胶原酶Ⅱ型(Gibico公司)，标准胎牛血清（杭州四季青公司），青霉素、链霉素、β-甘油磷酸钠、硝酸钴、硫化铵(Sigma公司)，NaCl、KCl、NaH2PO4·12H2O，K2HPO4、丙酮、硝酸钙、硫酸镁等试剂均为国产、分析纯。2试验方法2.1猪IEC的分离培养2.1.1主要试剂配制按照说明书配制DMEM-F12不完全培养基，0.22μm过滤除菌，分装，4℃避光保存备用。1gⅡ型胶原酶干粉溶于100ml上述配好的DMEM-F12不完全培养液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，1.5mlEppen-dorf管以1ml/管分装，-20℃保存备用。DMEM-F12完全培养基为DMEM-F12不完全培养基加10%的胎牛血清。2.1.2猪IEC的分离参照文献报道的方法[10－11]并根据实际情况调整,具体如下:将刚出生未吮乳的仔猪颈动脉放血处死,75％的酒精擦洗消毒后，置于超净工作台。无菌条件下打开腹腔,整体分离肠道,迅速投入盛有15ml37℃预热DMEM-F12不完全培养基的平皿中；分别取十《饲料工业》·2010年第31卷第1期营养研究10二指肠、回肠和空场各15cm左右，沿纵向剪开，培养基冲洗三遍并用玻片轻轻刮去表面杂物；清洗后的培养基转移到新的盛有15ml37℃预热DMEM-F12不完全培养基的平皿中，取出小肠，DMEM-F12培养基分离IEC细胞，用玻片轻轻分离肠粘膜组织；用移液器...