小鼠窦前卵泡的最佳共培养方法探讨VIP专享VIP免费

小鼠窦前卵泡的最佳共培养方法探讨卵泡是卵巢内的基本功能单位，包含一个卵母细胞、颗粒细胞及膜细胞〔1〕。卵泡膜间质细胞(theca－interstitialcells，TIC)是卵巢中除卵泡外具有分泌雄激素功能的间质细胞，它在卵泡的生长发育、闭锁过程中发挥着多种重要作用〔2－4〕，同时作为卵巢微环境的主体成分之一，TIC参与了卵巢衰老〔5〕及多囊卵巢综合征等卵巢相关疾病〔6〕的发生发展。为了能够进一步深入研究TIC对卵巢功能的影响及其作用机制，在体外构建一个可最大程度模拟体内环境下卵泡与TIC相互关系的共培养模型是十分有意义的。目前卵泡的培养主要包括二维法和三维法，而共培养方法包括直接接触式和非直接接触式。本研究拟采用海藻酸钠凝胶(alginatehydrogel，ALG)和Transwell构建3种共培养模型，从卵泡的形态观察、生长发育、存活率、激素分泌水平和减数分裂恢复情况等方面进行综合评价，旨在探索一种最佳的共培养方法。1材料和方法1.1实验动物由武汉大学动物实验中心提供SPF级C57BL/6小鼠，动物处理过程遵守动物保护与使用原则，并获华中科技大学同济医学院动物保护委员会批准。1.2主要试剂Lebovitz＇sL－15培养基(Invitrogen)、－MEM培养基(Hyclone)、注射用重组人促卵泡激素(Merckserono)、FBS(Gibco)及hCG(赤峰博恩药业有限公司)，其他试剂均购自sigma公司。1.3卵泡膜间质细胞的分离与培养分离21～25日龄C57BL/6雌鼠的卵巢，针刺以尽量多地释放出卵泡中的颗粒细胞。将残余组织充分剪碎后用消化液(McCoy＇s5a培养基+4mg/ml胶原酶Ⅳ+10%胎牛血清)37℃消化1h，每15min吹打1次。将消化好的细胞悬液进行离心(1000rpm，5min)，并用McCoy＇s5a培养基清洗1次。最后所得的细胞用TIC培养基(McCoy＇s5a培养基+10%胎牛血清+100IU/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素)重悬，接种于24孔板或Transwell滤膜(Corning，#3422)底侧面(倒置于12孔板中)，每孔细胞数约为1×105个，置于37℃、95%O2～5%CO2培养箱中培养24h，细胞贴壁后将Tranwell按正常位置置于24孔板中，加入TIC培养基。1.4窦前卵泡的分离用29号胰岛素针针头针刺14～16日龄C57BL/6雌鼠的卵巢，分离得到窦前卵泡，置于维持液(－MEM培养基+1%FBS+100IU/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素)中，37℃、95%O2～5%CO2培养箱中孵育30min。选择具备以下特征的健康卵泡用以下一步包埋或培养:①直径在110～140μm之间;②具有完整连续的基底膜，无明显因操作造成的卵泡损伤;③卵泡中央可见一个未成熟的卵母细胞;④无明显窦腔形成。1.5卵泡与卵泡膜间质细胞的共培养1.5.1海藻酸钠凝胶法将卵泡膜间质细胞接种于24孔板底部，孵育过夜，更换卵泡生长培养基(－MEM培养基+10%FBS+ITS+10mIU/mlFSH+100IU/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素)，600l/孔。将5个窦前卵泡转移至2%(w/v)无菌海藻酸钠液珠中，充分浸入包埋液(50mMCaCl2+140mMNaCl)中交联2min形成凝胶，再将海藻酸钠胶珠置入24孔板内，记为共培养第零天。1.5.2Transwell间接接触法将卵泡膜间质细胞接种于24孔板底部，更换500μl卵泡生长培养基，放入Transwell小室，加入100μl卵泡生长培养基，直接吸取5个卵泡转移至上室内。1.5.3Transwell直接接触法将培养于Transwell小室底侧面的卵泡膜间质细胞置于500μl卵泡生长培养基中，直接吸取5个卵泡转移至含100μl卵泡生长培养基的上室内。1.5.4培养基更换每组包含20～30个卵泡，于37℃、95%O2～5%CO2培养箱中培养6天，隔天半量更换新鲜配制的卵泡生长培养基，收集培养基冻存于－80℃，用于激素检测。1.6评价方法1.6.1卵泡形态、直径、存活率监测〔7〕:从第1天开始，隔天用倒置相差显微镜观察卵泡形态并拍照，用ImageJ软件测量卵泡直径(取长轴和短轴的平均值)。通过观察卵泡形态判断是否存活，将具有以下特征的卵泡视为死亡卵泡:①卵泡或卵母细胞碎裂、皱缩，尺寸缩减;②卵母细胞不再由颗粒细胞层包绕;③颗粒细胞变暗或碎裂。1.6.2激素分析收集共培养第2、4、6天1/2的培养基冻存于－80℃冰箱，用直接化学发光法测定睾酮、雌二醇。1.6.3卵母细胞的减数分裂能力评价〔7－8〕:培养结束后，用含10IU/ml海藻酸钠裂解酶的－MEM培养基替换原有的培养基，在37℃、95%O2～5%CO2培养箱中孵育3...