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细菌的简单染色和革兰氏染色生93沈睿2009012372同组成员：赵磊徐鲁斌实验日期：2011-3-17一．实验目的1.掌握细菌涂片的制备方法2.掌握细菌简单染色法和革兰氏染色法的原理及操作步骤3.学习无菌操作技术二．实验原理1.细菌的简单染色细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷易被带负电荷的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。简单染色法即在染色过程中只用一种染料。2.革兰氏染色细菌根据细胞壁结构可以分为两类，一类（G-）细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的脂类物质，而且肽聚糖层较薄，交联度低，当用乙醇脱色时，脂类物质被溶解，细胞璧通透性增加，甲紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌被脱色，再经番红复染就变成了红色。另一类（G+）细胞壁中肽聚糖层后且交联度高，脂含量少，经脱色反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留原来颜色。三．实验器材1.普通光学显微镜、酒精灯、打火机、接种环、载玻片、擦镜纸、擦镜液、镜油、无菌牙签2.菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、未知菌种S1、未知菌种S23.草酸铵甲紫染液、革氏碘液、95%乙醇溶液、番红染液四．实验步骤1.载玻片处理：洗净的载玻片浸泡在75%乙醇中，取一块纱布擦干，在涂菌位置的背面用记号笔画圈标记，涂菌部位用火焰烤，可除去油脂。2.涂片：左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试管培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层（背面有圆圈）即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上（或用无菌牙签从口腔里）挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。注意在拔或塞试管塞时，应将试管口在火焰处略加烧灼，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。3.干燥：涂片后室温下自然干燥，也可酒精灯上略加温，迅速干燥，但勿靠近火焰。4.固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3-4次，共约3-4秒。要求玻片温度不超过60oC，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。5.染色：初染：滴加1滴结晶紫染液，染色1分钟，水洗，吸干。（至此步骤后，直接进行镜检即为简单染色法的操作过程，但在简单染色中的可使用各种染液）媒染：再加1滴碘液覆盖涂片1分钟，水洗。脱色：用吸水纸吸去玻片上的残留水，用滴管滴加95%的乙醇脱色，轻轻摇动玻片直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。复染：滴加蕃红染液复染约2分钟，水洗。镜检：吸干水后，盖上盖玻片观察标本，注意细菌形态、大小、排列和颜色。五．实验结果1．普通染色结果图1枯草芽孢杆菌（400×）经草酸铵甲紫普染呈现紫色，另有特殊结构芽孢（箭头所指）2．革兰氏染色结果1）枯草芽孢杆菌图2枯草芽孢杆菌（1000×）染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌，另有特殊结构芽孢（箭头所指）2）大肠杆菌图3大肠杆菌（1000×）染色结果为红色，是革兰氏阴性菌3）金黄色葡萄球菌图4金黄色葡萄球菌（1000×）染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌4）酵母菌图5酵母菌（1000×）染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌，能观察到出芽（箭头所指）5）未知菌S2图6未知菌S2（1000×）染色结果为红色，是革兰氏阴性菌，从形状看应属于杆菌6）牙垢图7-1牙垢中的链杆菌（1000×）染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌图7-2牙垢中的杆菌和球菌（1000×）左菌群染色结果为红色，是革兰氏阴性菌；右菌群染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌图7-3牙垢中的链球菌（1000×）染色结果介于红色和紫色之间，红色可能是番红染液残留，故推断是革兰氏阳性菌7）革兰氏染色结果汇总菌种革兰氏染色结果形状菌体排列革兰氏鉴定结果枯草芽孢杆菌紫色杆状分散，偶成短链阳性大肠杆菌红色杆状分散阴性金黄色葡萄球菌紫色球状聚集阳性酵母菌紫色椭球状分散阳性未知菌S2红色杆状分散阴性牙垢（链杆菌）紫色杆状链状阳性牙垢（杆菌）红色杆状聚集阴性牙垢（球菌）紫色球状聚集阳性牙垢（链球菌）紫色球状链状阳性表1革兰氏染色结果汇总表六．实验讨论1.分析影响某一微生物的革兰氏染色结果的因素1）菌龄...