实验八 细胞内溶酶体和线粒体的荧光标记VIP专享VIP免费

细胞内溶酶体和线粒体的荧光活体染色实验原理•Mito-TrackerGreen是一种线粒体(mitochondria)绿色荧光探针，可以用于活细胞线粒体特异性荧光染色。Mito-TrackerGreen为采用MolecularProbes公司的carbocyanine进行了荧光标记的一种Mito-Tracker，分子量为671.88，可以用作线粒体特异性的荧光探针。和rhodamine123或JC-1相比，Mito-TrackerGreen对于线粒体的染色不依赖于线粒体膜电位。实验原理•Lyso-TrackerRed是一种溶酶体(lysosome)红色荧光探针，可以用于活细胞溶酶体特异性荧光染色。Lyso-TrackerRed为采用MolecularProbes公司的DND99进行了荧光标记的带有弱碱性的荧光探针，可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。中性红(NeutralRed)和吖啶橙(AcridineOrange)也都可以对溶酶体进行荧光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。1.1.实验目的实验目的•掌握荧光显微镜工作的原理•了解细胞器在细胞内的分布•了解荧光染料的使用方法Lyso-TrackerRed工作液的配制：•a.取少量Lyso-TrackerRed按照1:13333-1:20000的比例加入到细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中，使•最终浓度为50-75nM。例如取1μlLyso-TrackerRed加入到20ml或13.33ml细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的•HBSS)中。•2.溶酶体的荧光标记：•a.去除细胞培养液，加入步骤1配制好的并28℃预温育的Lyso-TrackerRed染色工作液，与细胞28℃共孵育30分钟。•b.去除Lyso-TrackerRed染色工作液，加入500微升预温的新鲜的细胞培养液或PBS漂洗。•c.取出盖玻片，在载玻片上滴一滴PBS，将盖玻片反扣在载玻片上，荧光观察•d.用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察。此时可观察到溶酶体呈明亮的强荧光染色。如果染色效果欠佳，可以提高Lyso-TrackerRed染色工作液中Lyso-TrackerRed的浓度或在推荐的时间范围内适当延长染色时间。使用说明：•1.Mito-TrackerGreen储存液的配制：•用无水DMSO(anhydrousdimethylsulfoxide)配制Mito-TrackerGreen至终浓度为1mM。配制后可以-20℃或更低温度避光保•存。•2.Mito-TrackerGreen工作液的配制：•a.取少量1mMMito-TrackerGreen储存液按照1:5000-1:50000的比例加入到细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的•HBSS)中，使最终浓度为20-200nM。例如取1μlMito-TrackerGreen加入到50ml或5ml细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中。混匀后即为Mito-TrackerGreen工作液。HBSSwithCa2+&Mg2+(C0219)可以向碧云天订购。•b.Mito-TrackerGreen工作液使用前需28℃预温育。•注：工作液中Mito-TrackerGreen的浓度可以根据实际情况进行适当调整。为降低背景，在染色效果可以接受的范围内，建议尽量使用较低浓度的Mito-TrackerGreen。•3.线粒体的荧光标记：•a.去除细胞培养液，加入步骤2配制好的并28℃预温育的Mito-TrackerGreen染色工作液，与细胞28℃共孵育15-45分•钟。•b.去除Mito-TrackerGreen染色工作液，加入500微升28℃预温育的新鲜细胞培养液或PBS漂洗。•c.取出盖玻片，在载玻片上滴一滴PBS，将盖玻片反扣在载玻片上，荧光观察。•d.用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察。此时可观察到线粒体呈明亮的强荧光染色。如果染色效果欠佳，可以提高Mito-TrackerGreen染色工作液中Mito-TrackerGreen的浓度或在推荐的时间范围内适当延长染色时间。1打开可将光和激发光光源（预热10分钟）2遮光板遮住激发光3选择“1”，在可见光下，聚焦，观察清晰图像，再调到高倍镜下，微调至清晰4关掉可见光光源，打开遮光板，让激发光透过5选择“G”观察红色荧光6选择“B”观察绿色荧光