AccQ—Tag法测定依替巴肽的氨基酸比值VIP免费

AccQ—Tag法测定依替巴肽的氨基酸比值目的：建立反相色谱法测定依替巴肽的氨基酸比值。方法：采用以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）與各氨基酸柱前定量衍生后，经反相色谱测定。结果：在范围内各氨基酸的线性关系良好，精密度，溶液稳定性，回收率均良好。结论：该方法准确可靠，重现性好，易于操作，可用于依替巴肽中氨基酸组成的测定。标签：AccQ-Tag；依替巴肽；氨基酸比值ABSTRACTOBJECTIVE：ToestablishanHPLCmethodfordeterminationofAminoacidratioineptifibatide.METHODS：the6-aminodecoquinate-N-hydroxylsuccinylimideformicether（AQC）wastakenasthederivativereagenttomakeforthecolumnquantitativederivatizationwitheachaminoacidandthentoelutebyReversephasechromatography.RESULTS：Goodlinearitieswereobtainedforallaminoacids.Themethodshowedhighselectivity，goodrepeatability，accuracyandstability.CONCLUSION：ThemethodissimpleandrapidanditisapplicablefordeterminationofAminoacidratioineptifibatide.KEYWORDSAccQ-Tag；ptifibatide；Aminoacidratio；氨基酸比值测定是多肽药物质量控制的重要环节，也是多肽原料药质量标准的重要组成部分，通过测定多肽药物的氨基酸理论个数比，从侧面佐证多肽的结构。因此，对氨基酸比值的分析，可为多肽的结构确证提供理论指导。建立准确可靠的氨基酸比值分析方法是一项有意义的工作。国内外研究和应用于实际样品中氨基酸比值分析的方法主要是色谱方法，包括离子交换法、反相高效液相色谱法、气相色谱法［1］，按检测方法可分为化学分析法、电化学方法、分光光度法等，按衍生反应的先后，可分为柱前衍生［2］和柱后衍生法。氨基酸分析仪是柱后衍生反相高效液相色谱法的代表，已有很广泛的应用。在柱前衍生反相高效液相色谱法方面，不同的衍生剂对应不同的方法，是目前研究的主体模式。笔者采用WATERS公司的AccQ-Tag试剂包［3］作为构建方法的基本条件，通过优化依替巴肽中氨基酸的前处理和色谱条件，以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）为衍生试剂与各氨基酸柱前定量衍生后，再经普通C18柱梯度洗脱，建立了依替巴肽中氨基酸比值的AccQ-Tag测试方法，应用于实际样品的分析。结果表明，此方法具有专属性，灵敏度高、重现性好。1实验部分1.1仪器及试药L-门冬氨酸（批号：A0546）、甘氨酸（批号：G0099）、L-高精氨酸（批号：GJ01）、L-脯氨酸（批号：P0481）、L-胱氨酸（批号：C0519）对照品均购于：东京化成工业株式会社；依替巴肽原料药（批号：20071019连云港宏创药业有限公司）；AccQ-Tag试剂盒（Waters）；乙腈、磷酸为色谱纯，三乙胺、盐酸、氢氧化钠、无水乙酸钠，乙二胺四乙酸钠均为分析纯。Agilent1200系列（G1311A四元泵，G1329A自动进样器，G1316A柱温箱，G1314B紫外-可见光检测器），Agilent化学工作站；梅特勒XS105电子分析天平；色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。1.2实验方法1.2.1AccQ-Tag衍生溶液的制备取衍生化试剂（2A）加人1ml乙腈，于55°C恒温鼓风干燥箱内使溶解，得衍生溶液。1.2.2供试品溶液的制备取依替巴肽原料药约10.5mg，于裂解瓶中，加入5mL6mol/L的盐酸溶液，充氮密闭，于120C条件下反应24小时，取出放置至室温，用氢氧化钠溶液中和至中性，转移至50ml量瓶中，用水定容，精密移取100卩1置进样瓶中，加入700卩1硼砂缓冲溶液，再加入200卩1已配制好的衍生化试剂溶液，混匀后，放入已恒温至55C的电热恒温鼓风干燥箱中，反应10分钟后，作为供试品溶液。1.2.3对照品溶液的制备精密称取门冬氨酸（Asp）对照品16.6mg，甘氨酸（Gly）对照品9.4mg，高精氨酸（Harg）对照品28.0mg，脯氨酸（Pro）对照品14.4mg，胱氨酸（Cys）对照品15.0mg，置于50ml量瓶中，用水溶解并稀释到刻度，混匀；精密移取2ml置裂解瓶中，加入6mol/L的盐酸5ml，充氮密闭，于120C条件下反应24小时，取出放置至室温，用NaOH中和至中性，转移20ml量瓶中，用水定容，用水稀释到刻度，混匀；精密移取100卩1置进样瓶中，加入700卩1硼砂缓冲溶液，再加入200卩1已配制好的衍生化试剂溶液，混匀后，...