荧光定量实验全流程RNA提取准备工作1.ImL、200ul、10ul枪头盒，浸泡在0.1%DEPC处理水中过夜，报纸包好高压灭菌，入烘箱烘干。2.配制0.1%DEPC水，0.1%DEPC水=1000ml双蒸水+1mlDEPC，通风橱放置过夜，高压灭菌，灭菌时将瓶盖拧松但不脱落，灭菌结束后迅速将瓶盖拧紧，冷却至室温后放入4□冰箱冷却，使用前在超净台内分装成小管待用，避免污染。3.配制75%乙醇（DEPC水配置），配好放入4□冰箱预冷保存。4.氯仿、异丙醇4□冰箱预冷。注意:DEPC试剂毒性较强，操作时注意做好防护措施，避免吸入和溅到皮肤，浸泡枪头盒的0.1%DEPC处理水需要高压灭菌后才能倒入下水道。二、提取RNA1.磨样：将组织样品在研钵中磨成粉，装入有1mlTrizol的1.5ml无菌无酶EP管中，震荡混匀，静置5-10min；细胞样品直接加入1ml预冷的Trizol，震荡混匀，静置5min。2.装有样品的1.5mlEP管中加入200ul氯仿，震荡1min，冰上静置5min,离心（12000g，4口，10min）3.离心后液体分层上层无色液体（RNA）,中层白色（DNA）,下层红色（protein）。小心吸取上层无色液体，不要触碰到中层白色，加入新的无菌无酶EP管中，约400ul。4.加入等体积的异丙醇（400ul）,混匀，用力震荡，冰上静置10-15min,离心12000g,4口，15min)5.弃掉上清液，加入lml75%乙醇，振荡，洗涤，离心8000g,4口，lOmin)6.重复步骤5洗涤7.小心弃去上清液，超净台内EP管倒置在滤纸上干燥使75%乙醇完全挥发。8.根据RNA沉淀大小，加入适量O.l%DEPC水反复吹打直至溶解，5Oul左右。9.测定RNA浓度三、RNA电泳鉴定RNA很容易讲解，跑电泳的时候也容易降解，最好换新的电泳液。电泳点样量不要太大，太多的话不仅容易使RNA降解，还有影响电泳效率，跑不开。标准的RNA电泳图四、逆转录反应根据试剂盒说明书操作，实验室主要使用Takara试剂盒，货号RR047A，在Takara官网下载详细说明书。操作方法：Takara——RR047Al.去除基因组DNA反应按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制MasterMix，然后再分装到每个反应管中，最试剂使用量步骤1的反应液10.0plPrimeScriptRTEnzymeMixI1.0plRTPrimerMix1.0pl5xPrimeScriptBuffer2(forRealTime)4.0plRNaseFreedH2O4.0plTotal20pl*2MasterMix试剂使用量5xgDNAEraserBuffer2.0p!gDNAEraser1.0plTotalRNA*1RNaseFreedH2Oupto10plRNA,探针qPCR分析法最多可使用2昭的TotalRNA。2.反转录反应反应液配制请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时,应先按反应数+2的量配制MasterMix,然后再分装10^1到每个反应管中。85C5sec4C轻柔混匀后立即进行反转录反应。后加入RNA样品。反应条件：37°C15min反应条件：42口2min4口*1:20卩1反转录反应体系中，TBGreenqPCR法最多可使用1建的Total试剂使用量2xMasterMix5plForwardPrimer(10pM)0.4plReversePrimer(10pM)0.4plcDNA模板1plddHO23.2plTotal10pl反应条件：943min*2:反转录体系可以根据需要相应扩大。注意：逆转录前可以将所有RNA样品浓度调节一致(1000ng/ul),如果不统一稀释则保证每管所加RNA量相同。建议将所有RNA样品稀释到同一浓度再进行逆转，方面后续荧光定量反应的操作。cDNA需要长期保存时，请于-20□或更低温度保存。五、引物稀释根据引物合成报告书和管上标签提示进行稀释操作，稀释成10yM,分装在200ulPCR管内备用，-20□保存。五、引物验证用逆转录得到的cDNA做普通PCR反应(按说明书操作)，PCR产物做琼脂糖凝胶电泳，检测扩增片段的长度是否与引物目的条带一致。普通PCR反应：根据具体试剂盒的说明书，以下仅参考。琼脂糖凝胶电泳：配制2%凝胶：1g琼脂糖粉+50mlTAE(1x)微波炉内加热至完全溶解，加入2-3ul染料摇匀，倒入制胶板内冷却凝固(20-30min),小心拔出梳子将凝胶放入电泳槽内，点样(PCR产物加DNAloadingbuffer，点样前)，电泳20-25min左右，成像，根据DNAmarker条带判断扩增产物长度。六、荧光定量根据试剂盒说明书操作，实验室主要使用Takara试剂盒，货号RR820A，在Takara官网下载详细说明书。应用LightCycler480System的操作方法:TakaraRR820A1.按下列组份配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)...
