实用标准文案精彩文档酶联免疫吸附实验ELISA－－操作规则（新手适用）一、实验目的酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原)，再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。二、实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A(1cm403nm1%)＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml计算是HRP的A(1cm403nmmg/ml=2.5)HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nm纯度RZ（ＲeinheitZahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。实用标准文案精彩文档（二）酶与底物酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。免疫技术常用的酶及其底物酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺橘红色492*四甲替联苯胺黄色460**氨基水杨酸棕色449邻联苯甲胺兰色4252，2'-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐蓝绿色642碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)黄色400萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐红色500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖黄色405，420葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰深蓝色β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)荧光360，450硝基酚半乳糖苷(ONPG)黄色420*终止剂为2mol/LH2SO4实用标准文案精彩文档**终止剂为2mol/L柠檬酸，不同的底物有不同的终止剂。可催化下列反应：HRP+H2O2→复合物复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+AAH2——为无色底物，供氢体；A——为有色产物。（三）ELISA常用的四种方法1．直接法测定抗原将抗原吸附在载体表面；加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；加底物。底物的降解量＝抗原量。2．间接法测定抗体将抗原吸附于固相载体表面；加抗体，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。测定底物的降解量＝抗体量。3．双抗体夹心法测定抗原将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;加抗原，形成抗原-抗体复合物;加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体);加底物。底物的降解量＝抗原量。4.竞争法测定抗原将抗体吸附在固相载体表面;(1)加入酶标抗原；(2)，(3)加入酶标抗原和待测抗原；实用标准文案精彩文档加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。三、仪器和材料1.聚苯乙烯微量细胞培养板(平板，40，96孔)。2.酶联免疫检测仪3.辣根过氧化物酶羊抗兔IgG，工作稀释度1:1000。4.包被液:：0.05mol/LpH9.6碳酸缓冲液，4℃，保存，Na2CO30.15克，NaHCO30.293克，蒸馏水稀释至100ml。5.稀释液：0.01mol/LpH7.4PBS--Tween--20，４℃，保存.NaCl8g，KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H2O2.9g，Tween—20，0.5ml.蒸馏水加至1000ml。6.洗涤液：同稀释液7.封闭液：0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4PBS。8.邻苯二胺溶液(底物)：临用前配制0.1M柠檬酸(2.1g/100ml)，6.1ml0.2MNa2HPO4.12H2O(7.163g/100ml)6.4ml，蒸馏水12.5ml，邻苯二胺10mg，溶解后，临用前加30%H2O240微升。9.终止液：2mol/LH2SO4。四、操作步骤1.包被抗原：用包被液将抗原作适...
