课题3-血红蛋白的提取和分离-(2)VIP免费

复习课：血红蛋白的提取和分离课题目标1.说出从血液中初步获取血红蛋白的原理和方法；2.说明凝胶色谱法的原理和方法；3.说出电泳的基本原理和方法；4.运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。一、基础知识（一）蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物理化学性质差异1.分子的形状、大小2.电荷性质和多少3.溶解度4.吸附性质5.对其他分子亲和力（二）方法及原理方法原理凝胶色谱法电泳法根据相对分子质量的大小分离蛋白质根据分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同分离蛋白质1.凝胶色谱法（1）材料：凝胶微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道。（2）原理：小蛋白质大蛋白质混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子2.缓冲溶液(3)配制：通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。(1)概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。(2)作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。(4)本实验使用的是磷酸缓冲液(NaH2PO4/Na2HPO4),目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。3.电泳法（1）概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。（2）原理：分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。（3）类型：琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质－SDS复合物，使其迁移速度完全取决于分子的大小二、实验操作血液组成成分1.洗涤红细胞2.释放血红蛋白3.分离血红蛋白4.透析血红蛋白样品处理和粗分离纯化纯度鉴定血液血浆水分固体物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团2.问题：血液有哪些成分？1.问题：用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白的特点：1.洗涤红细胞血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色（一）样品处理2.释放血红蛋白洗涤好的红细胞导入烧杯加蒸馏水到原血样体积加40﹪体积苯充分搅拌10分钟3.分离血红蛋白红细胞混合液高速离心10min离心管滤纸过滤脂类物质有机溶剂血红蛋白烧杯(4)透析：①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。②目的：除去样品中分子量较小的杂质。（二）凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作2.凝胶色谱柱的装填3.样品的加入和洗脱1.凝胶色谱柱的制作打孔→挖穴→安管→覆网→纱包→插管2.凝胶色谱柱的装填50cm高固定色谱柱－配凝胶悬液－装填色谱柱－洗涤平衡沸水浴加热紧密不得有气泡磷酸缓冲液(pH为7.0）3.样品的加入和洗脱1.调液面2.加样3.再调液面4.洗脱5.收集缓冲液凝胶红色区带均匀一致地移动。三、操作提示1.红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2.色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。3.凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡。4.色谱柱成功标志：四、结果分析与评价1.血液样品的处理分层明显→样品处理完成2.凝胶色谱柱的装填放一支与凝胶柱垂直的日光灯直接检查加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，若色带均匀、...