课题3-血红蛋白的提取和分离VIP免费

本课题学习目标本课题学习目标简述蛋白质提取和分离的基本原理，并了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。11、主要概念：、主要概念：①凝胶色谱法②电泳法③缓冲溶液④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2.2.主要原理：主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理②电泳法分离样品的原理③缓冲溶液的组成和作用机理33、课题重点：、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法44、课题难点：、课题难点：①样品的预处理②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。1.1.分离生物大分子的基本思路：分离生物大分子的基本思路：选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2.2.蛋白质分离和提取的原理：蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。基础知识基础知识基础知识（一）凝胶色谱法（基础知识（一）凝胶色谱法（分配色谱法分配色谱法））2.2.凝胶：凝胶：大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。1.1.概念：概念：3.3.凝胶色谱法的原理凝胶色谱法的原理分子量大小直径大小大于凝胶颗粒空隙直径，被阻挡在颗粒的外面小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部运动方式垂直向下移动垂直向下移动，无规则扩散进入颗粒内部运动速度较快较慢运动路径较短较长洗脱次序先从凝胶柱洗脱出来后从凝胶柱洗脱出来一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理4.4.具体过程具体过程凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示•用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质•A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快•C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快D（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液1.1.概念概念::在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。2.2.作用作用::3.3.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制::通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。4.4.提问：在本课题中使用的缓冲液提问：在本课题中使用的缓冲液是是:__________:__________,其目的是其目的是::磷酸缓冲液利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色红色)和科学研究(活性活性)思考：说出人体血液中缓冲液NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3（三）电泳：（三）电泳：1.1.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.2.原理：原理：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3.3.类型类型::琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳SDS——SDS——聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳((十二烷基磺酸十二烷基磺酸钠钠))蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。二、实验操作二、实验操作样品处理粗分离纯化纯度鉴定血液组成成分1.洗涤红细胞2.释放血红蛋白3.分离血红蛋白4.透析血红蛋白二、实验操作二、实验操作血血液液血浆血浆水分水分其他物质：其他物质：血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细血细胞胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白（（9090％）％）两个两个αα－肽链－肽链两个两个ββ一肽一肽链链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团2.2.血液有哪些成分？血液有哪些成分？1.1.用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取DNADNA，用哺乳动物的红细胞提，用哺...