PriCells –正常小鼠原代骨骼肌细胞培养一、实验试剂1、培养基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement2、冻存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO3、洗涤液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S4、染色液： 0.4% Trypan Blue5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit6、检测试剂：鼠抗人及大鼠 desmin 一抗，肌球蛋白（myosin）单克隆抗体 二、实验器械1、培养皿2、培养瓶3、直剪和眼科剪4、眼科镊和止血钳5、烧杯6、15ml 离心管 三、实验流程取肌肉于平皿，Hank’s 洗 3 次↓剔除脂肪、结缔组织↓肌肉标本剪约 0.1cm3 小块↓移至离心管，Hank’s 洗 3 次↓静置 1min，弃去上层液及漂浮组织↓0.25%胰酶，37 度水浴消化 20min，每 5min 摇动或吹打 1 次↓生长培养基终止消化，反复吹打，依次 100，200，400 目过筛↓离心，1000rmp,10min，弃去上清↓重悬，计数细胞，接种密度以 5 × 105个/ml↓悬液加入未经 PPL 包被培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37 度，1h↓转移包被瓶中，生长培养基培养，培养 37℃，5%CO2↓4d 换液，以后每天换 四、实验操作 1、 新生小鼠拉颈椎处死，乙醇消毒腿部，在超净工作台内，取肌肉于平皿，Hank’s 洗 3 次，剔除脂肪、结缔组织，将肌肉标本剪约 0.1cm3 小块；2、 将剪碎的肌肉移至离心管，Hank’s 洗 3 次，静置 1min，弃去上层液及漂浮组织3、 向上述离心管中加入 0.25%胰酶，37 度水浴消化 20min，每 5min 摇动或吹打 1 次离心管，然后加入生长培养基终止消化；4、 反复吹打后，依次 100，200，400 目过筛，滤液收集后，1000r/min 离心 10min；5、 弃去清夜，用生长培养基重悬细胞，悬液加入未经 PPL 包被的培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37 度培养 1h 后，转移包被瓶中，生长培养基培养，4d 换液，以后每天换液 1 次。 五、细胞鉴定 1、显微鉴定：刚分离出的原代细胞比较小，呈球形，折光性强。12h 后，细胞开始贴壁，72h 后贴壁完全，细胞逐渐延展成梭形，随着培养时间的延长，细胞增殖、迁移并逐渐规律性地沿一个方向排列。当细胞融合 80%以上后，开始形成肌管。 2、免疫细胞化学染色 1：肌卫星细胞胞浆中含有结蛋白（desmin），可采用鼠抗人及小鼠desmin 一抗对卫星细胞进行免疫染色鉴定。 3、免疫细胞化学染色 2：采用骨骼肌特异性的肌球蛋...
