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PBMC 分离及冻存流程PBMC 分离及冻存流程本实验采用密度梯度离心原理（Ficoll 密度为 1.077，PBMC 平均密度为 1.072），并通过反复离心洗涤，获得相对较纯的 PBMC。1.试剂与耗材DPBS (PH=7.4, GIBCO, C14190)，RPMI 1640 (GIBCO, C22400)，FBS (GIBCO,10099)，Ficoll分离液（LymphoprepTM, 1114740），台盼蓝（Sigma, 117K2332），DMSO(Sigma, D5879-1l)，15ml 和 50ml Falcon 离心管2.缓冲液配置P0：即不含 FBS 的 PBSR0：即不含 FBS 的 RPMI 1640R10：即 10%FBS 的 RPMI 1640冻存液：即含 10%DMSO 的 FBS所有液体配置后 4°Ｃ保存，使用前 30 分钟平衡至室温。3.分离步骤（以每份血样 25ml 为例）1)在分离前 30 分钟，准备超净台，将缓冲液(P0, R10)和 Ficoll 分离液复温至室温；每个患者 20ml 的肝素钠抗凝血（绿色帽管），需要 50ml 离心管 2 个，15ml 离心管 3~4 个2)登记样本基本信息，姓名，ID 号，采血日期； 3)650g 离心 7min，30ml 血一共可留取 3~4ml 血浆（2ml ep 管 圆底的 3 管）,以尽量不吸取到红细胞为原则，注意无菌操作，巴斯管不能伸进 ep 管。4)吸取的血浆离心 3000rpm，10min，吸取上清。5)每位患者需要分装为 4 管血浆（1.5ml ep 管），血清视情况（10ml 普通帽管）而定，1.5ml离心管每管 1ml；5ml 普通管中吸出 300~400ul 到 1.5ml EP 管中，标记后和 HBV DNA 申请单卷在一起，然后把 5ml 的普通管与雅培申请单卷在一起，送到血清室，反别放入相应的盒子中（盒子在台上或在透明玻璃门冰箱里），血清血浆放到小实验室卧室冰箱中。6)在 50ml 离心管中，加入 PBS（2 倍稀释），用巴斯管反复混匀剩下的血，倒入离心管中，反复混匀再转移至加入 5ml Ficoll 分离液的 15ml Falcon 离心管 3 或 4 管（这样的分离效果会均匀一些，避免有一些管 PBMC 多一些）7)个别患者离心完第 1 步之后可能会呈现云雾状细胞团，吸取 PBMC 之后吹散即可，离心完第 2 步之后一定要彻底打散细胞。）8)将稀释的血液缓慢加入 Ficoll 分离液的表面（倾斜 45 度）；9)按程序 1 离心(800 g，25 分钟，室温，加速/减速设置为 1)；PBMC 分离及冻存流程10) 轻柔的收集淋巴细胞带置于新的 50ml Falcon 离心管（1 支），并加入 PBS 至 50ml；尽量避免吸到分离液。11) 按程序 2 离心(1800 rpm，10 分钟，室温，加速/减速...