PCR 实用技巧 ★ ★ 350784478(金币+2,VIP+0):感谢分享 7-13 15:43 增加 PCR 的特异性： 1. primers design 这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件 a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量 b. GC% 40%~ ~ ~ ~ 60% c. 5'端和中间序列要多 GC,以增加稳定性 d. 避免 3'端 GC rich, 最后 3 个 BASE 不要有 GC,或者最后 5 个有 3 个不要是 GC e. 避免 3'端的互补, 否则容易造成 DIMER f. 避免 3'端的错配 g. 避免内部形成二级结构 h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到 5'端, 在算 Tm 值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们 i. 使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在 3'端使用兼并引物,并使用 较高的引物浓度(1uM-3uM) j. 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al. * 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当 50％的引物和互补序列表现为双链DNA 分子时的温度.Tm 对于设定 PCR 退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到 70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm 低 5℃。 设定 Tm 有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18 碱基的引物。 有的是根据 GC 含量估算 Tm。确定引物 Tm 最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和 相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。 根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm 会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的 Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的 Tm5℃，以 2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。 为获得最佳结果，两个引物应具有近似的 Tm 值。引物对的 Tm 差异如果超过 5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物 Tm 不同，将退火温度设定为比最低的 Tm 低 5℃ 或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm 设计的退火温度先进行 5 个循环，然后在根据较低...
