完整版western+blotting试验操作步骤VIP专享VIP免费

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot, WB ）WB是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗 /二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB 是进行微量蛋白质分析比较成熟的技术之一。以下是总结Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成 WB。A 第一部分：蛋白样本提取制备蛋白样品制备是 Western Blotting的第一步，更是决定 WB成败的关键步骤， 总体原则和注意事项：1. 尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）；2. 保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、表面活性剂、还原剂等的选择）；3. 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）；4. 尽量去除核酸， 多糖，脂类等干扰分子 （通过加入核酸酶或采取不同提取策略）；5. 样品分装，长期于 -80℃中保存，避免反复冻融。方法的选择自行配制抽提试剂，根据文献方法或经验提取；购买商品化试剂盒，按其说明书的方法提取。Example 1 ：实验中提取肾脏总蛋白，具体实验过程如下：1. 提前一天 4℃解冻 RIPA，一定要完全融化；配PBS（用于细胞试验则需高压） ；2. 配制裂解液： PMSF:RIPA=1:99,PMSF 终浓度为 100mM（根据样本数配制所需的量，临用临配）；3. 裂解组织：每个样品称取100mg，加 1ml 裂解液，匀浆后4℃静置 2h 使其充分裂解， 14000g，4℃离心 10min，取上清。4. 蛋白定量：取少量上清稀释30 倍蛋白定量，然后计算出各样本原液蛋白浓度。注意由于裂解液里含有较高浓度的洗涤剂，蛋白定量不能选用Bradford 法，可以选用改良的 Lowry ’s 法或者 BCA 法。5. 样品蛋白浓度均一化：根据蛋白定量计算的结果将各样品蛋白浓度调整一致。具体方法为加入 PBS 稀释至样品浓度一致，本次蛋白浓度为3mg/ml。6. 分装并存于 -80℃，避免反复冻融。B 第二部分：相关试剂的配制：1.10%的 SDS（戴口罩称取）：称取 SDS10g，先加双蒸水 80ml，再用磁力加热搅拌助溶，然后定容至100ml。室温保存，如在长期保存中出现沉淀，可在50℃水浴溶化后，仍可使用。2.1.5M Tris/HCL （pH8.8）Trisbase 18.17g，溶解于 80ml 双蒸水，用浓盐酸调 pH 至 8.8，最后定容至 100ml，室温下保存。3.0.5M Tris/HCL （pH6.8）Trisbase 6.06g，溶解于 80ml 双蒸水，用浓盐酸调 pH 至 6...