Peptide Pull-dow n 方案 设计好的备用肽段（C 端末尾加几个残基作为连接臂并且末端偶联生物素，）应被色谱纯化至纯度大于80%，等分，冻干，干燥环境下于—80度储存 1 连接肽段的珠子的制备：（注意，制备的所有步骤都应在冰上或最多4度的环境下进行） 1 用1mL 磷酸盐缓冲液加0.1%的表面活性剂 Triton X-100，冲洗400微升的亲和素珠（离心？（microcentrifu ge），500RCF，30s）移去上清液，至少洗三次（洗去表面的保护剂，表面活性剂 Triton X-100也促使疏水性的珠子与水相分离，否则无法得到上清液） 制 备 两 个 400 µ L 的 珠 子 ， 其 中 一 份 不 偶 联 肽 段 作 为 只 有 珠 子 的 对 照 组 。用 装 有 毛 细 管 凝 胶的 移 液 器 尖 端 来 取 上清液 ，从而避免移 去珠子 2 使100微克偶联生物素的肽段重新悬浮在400微升磷酸盐缓冲液（PBS）中 这 些 肽 段 的 量 足 够 配 400 µ L 偶 联 肽 段 的 珠 子 ， 做 20次pull—down， 如果珠 子 有 着不 同的 连接生物素能力， 注意将肽 段 和亲和素比例调整合适 3 将2中制备好的400微升重新悬浮的肽段加入400微升洗过的珠子中，旋转（rotation），在室温下温育3到5h 也可在4度过夜温育 4 用1 mL PBS + 0.1% Triton X-100冲洗连接了肽段的珠子至少三次，来移除未连接上的肽段 5 将偶联了肽的珠子重新悬浮在400微升磷酸盐缓冲液中来制备50%的悬浮液，在4度下储存 若长期储存， 加叠氮化钠到浓度为 0.1%， 4度下至少可储存1个 月。甲基化修饰稳定， 磷酸化修饰不 稳定 2 用固定好的肽段从复杂混合物中钓蛋白 一些一般原则： 1 在实验的每一步中都要确保蛋白酶抑制剂的使用，防止蛋白的降解。 2 都应在冰上或最多4度的环境下进行。 3 必须加未偶联肽的珠子作为阴性对照。 4 除 HEPES 缓冲液外在这次试验中也可使用其他缓冲液 5 所有肽段平行处理 制备蛋白质的复杂混合物 1 每次实验从 108 数量级的细胞（问题：细胞培养）中制备新鲜核提取物，采用标准的高盐溶液提取方案 总 量108 数 量 级 的 细 胞 一般 来 说 基 本 足 够 了 ， 最 好 用 新 鲜 核 提 取 物 防 止 蛋 白 降 解 ， 不 过 提取物可先快冻在液氮中再在-80°C 储存， 从 不 同 细 胞 系 中 提 取 是 很 重 要 的 ， 因 为 有些...
