SDSPAGEVIP免费

在用 SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量时，应注意以下几个问题： 1．如果蛋白质-SDS 复合物不能达到 1.4 克 SDS/1 克蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能得到准确的结果。影响蛋白质和 SDS 结合的因素主要有以下 3 个：（1）二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下， SDS 才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。一般以巯基乙醇作还原剂。在有些情况下，还需进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。（2）溶液中 SDS的浓度：溶液中的 SDS 的总量，至少要比蛋白质的量高 3 倍，一般需高达 10 倍以上。（3）溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最高不能超过 0.26，因为 SDS 在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在的，SDS 结合到蛋白质分子上的量，仅决定于平衡时 SDS 单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中，SDS 单体具有较高的平衡浓度。 2．不同的凝胶浓度适用地不同的分子量范围，Weber的实验指出，在 5%的凝胶中，分子量25,000—200,000 的蛋白质，其分子量的对数与迁移率呈直线关系；在 10%的凝胶中，10.000—70,000 分子量的蛋白质呈直线关系；在 15%的凝胶中，10,000—50,000 分子量的蛋白质呈直线关系；3.33%（以上各种浓度的凝胶，其交联度都是 2.6%）的凝胶可用于分子量更高的蛋白质。 可根据所测分子量范围选择最适凝胶浓度，并尽量选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白质。标准蛋白质的相对迁移率（蛋白质的电泳迁移距离除以染料迁移距离即为相对迁移率，详见后）最好在 0.2—0.8 之间均匀分布。 在凝胶电泳中，影响迁移率的因素较多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制得完全一致，因此，用 SDS-凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。 3．有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如 α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在 SDS 和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。 2．试剂： （1）标准蛋白质 目前国内外均有厂商生产低分子量及高分子量标准蛋白质成套试剂盒，用于...