SDSPAGE凝胶电泳2VIP免费

SDS-PAGE凝胶电泳SDS-PAGE凝胶电泳实验原理实验步骤注意事项SDS-PAGE的优点SDS-PAGE的缺点实验常见问题及处理小技巧实验步骤１．试剂配制(1)30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中。4℃，1～2月（2）10%SDS（十二烷基磺酸钠）（3）1.5mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.8)：称取Tris18.2g,加入50ml水,用1mol/L盐酸调pH8.8,最后用蒸馏水定容至100ml。（4）1.0mol/LTris-HCl缓冲液(pH6.8):称取Tris12.1g,加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8,最后用蒸馏水定容至100ml（5）0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)：称取Tris0.6g,加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0,最后用蒸馏水定容至100ml（６）TEMED（四甲基乙二胺）（７）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/LpH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml（８）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀（９）染色液：称取考马斯亮蓝R2500.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用（1０）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml（1１）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml２.聚胶前准备(1)配制10％过硫酸铵溶液(需每天新鲜配制)。(2)将单体储存液、缓冲液、水按照一定比例配制成凝胶溶液。(3)将灌胶装置准备好。(4)待凝胶溶液平衡至室温(23~25)℃后，真空脱气15min。３．不连续系统下层分离胶的聚合在10ml凝胶溶液中加入10％过硫酸铵50μl(最终浓度为0.05％)，TEMED原液5μl(最终浓度为0.05％)。轻缓地摇动溶液(8~10下)，使激活剂混合均匀。将凝胶溶液平稳地注入两层玻璃板中(注意要以连续平稳的液流从中间位置注入)，再在液面上小心注入一层水或正丁醇(约2~3mm高)，以阻止氧气进入凝胶溶液中，然后静置至少90min。４．不连续系统中的上层浓缩胶和连续系统凝胶的聚合连续系统只含一种凝胶，它和不连续系统中的浓缩胶具有相同之处，即在其液面处与空气相接触，因此激活剂的含量应相应地增加，在10m1凝胶溶液中加入10％过硫酸铵50μl(最终浓度0.05％)，TEMED原液10μl(最终浓度0.1％)。同前将激活剂混合均匀，但摇动溶液时不要摇得过于剧烈以免引入过多的氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡。静置90min以上以保证完全聚合。如果在聚胶过程中发现一道道纹线，即凝胶不均匀，可能是聚合速度太快或激活剂未充分混合导致局部浓度过高。凝胶聚合的速度可以通过紫外吸收检测，由于丙烯酰胺中的双键在260nm有吸收，聚合后双键消失，光吸收减低。将凝胶溶液倒入石英比色杯中，可观察到20~30min后光吸收读数开始下降，至80min以后趋于稳定，说明聚合完成。５．电泳将聚合好的凝胶板安置于电泳槽中，上样，选择适当的电压进行电泳。垂直板电泳装置加样样品迁移方向水平式电泳装置电泳缓冲液凝胶电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品带孔胶按分子大小分离电泳方向电泳小分子大分子６．染色和脱色电泳完毕需通过染色和脱色评定其结果的优劣，此外根据不同的研究目的，也可将凝胶直接进行放射自显影及电印迹。电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后的凝胶照片７.结果处理测量并计算分子量蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式，经37种蛋白的测定得到以下的关系式Mw＝K(10－bm)(1)lgMw=lgK－bm=K1－bm(2)其中MW是蛋白质分子量；K和K1为常数b为斜率，m是电泳迁移率，实际使用的是相对迁移率mR。mR=dpr/dBPB夹在两块玻璃板之间的凝胶电泳缓冲液电泳缓冲液加在槽中的经SDS处理的样品分子量小分子量大电源标准蛋白分子量未知蛋白在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。相对迁移率实验注意事项1.形成凝胶的试剂要有足够的纯度：丙烯酰胺是形成凝胶溶液中的最主要成份，其纯度的好坏将直接影响凝胶的质量，丙烯酰胺可...