地高辛标记探针的Southern 杂交 （DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit I ，Cat.No.11 745 832 910，Roche Diagnostics GmbH，Germany ） 1. 探针标记步骤（20µ l 体系）： 1) 将10ng-1µg 模板DNA用无菌去离子水补足至16µ l。 2) 沸水浴或干浴锅98 ℃ 10分钟，使 DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。 3) 充分混匀 DIG-high Primer （1#管），并取 4 µ l至变性 DNA管，混匀并离心。 4) 37 ℃温育 1小时或过夜（最大到不超过 20小时）。 5) 停止反应，加 2 µ l 0.2M EDTA（pH 8.0）或65 ℃加热 10分钟。 2. 探针标记效率检测： 将地高辛标记好的探针作一系列的稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的control DNA作对照标准，120℃固定 30分钟；然后用地高辛抗体免疫检测，按 BNT/BCIP显色步骤显色；比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。操作步骤如下： 1) 根据表 1 DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记产量将标记的探针稀释到 1ng/μ l，将试剂盒提供的control DNA稀释到 1ng/μ l (原始浓度是 5ng /μ l)，然后按照表 2作一系列的稀释探针及 control DNA 表 1 DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量 Template DNA 1 h 20 h 10 ng 45 ng 600 ng 30 ng 130 ng 1050 ng 100 ng 270 ng 1500 ng 300 ng 450 ng 2000 ng 1000 ng 850 ng 2300 ng 3000 ng 1350 ng 2650 ng 表2 探针DNA及Control DNA 系列表 Tube DNA (µ l) From Tube # DNA dilution buffer(μ l) Dilution Final concentration 1 Diluted orginal 1ng/µ l 2 2 1 198 1:100 10 pg/µ l 3 15 2 35 1:3.3 3 pg/µ l 4 5 2 45 1:10 1 pg/µ l 5 5 3 45 1:10 0.3 pg/µ l 6 5 4 45 1:10 0.1 pg/µ l 7 5 5 45 1:10 0.03 pg/µ l 8 5 6 45 1:10 0.01 pg/µ l 9 0 - 50 - 0 2) 将上述稀释的2-9 号管的control DNA 及探针DNA各取1μ l点膜 3) 120℃固定 30分钟或紫外交链 3-5分钟 4) 将膜放入装有 20ml Maleic acid buffer 的塑料器皿中，室温振荡 2分钟 5) 将膜放入 10ml Blocking solution中室温温育 30分钟 6) 将膜放入 10ml Antibody...
