北京大学生科院／CLＳ生物信息平台RNA-Ｓeq测序数据分析服务流程(试运行2015.３平台联系人:李程(ｌcｈ3000@gｍａil.com文档撰写：张超TaｂｌeofCｏntｅｎts1.测序质量评估（3１.１测序数据过滤(3１.2质量值分布（３１.3GC含量分布(42．参考序列比对(4３.基因表达水平(63．1基因表达水平定量(63.2基因表达水平分步(６3.3生物学重复相关性分析(63.4样本间层次聚类及PCA分析(７4.差异基因分析(74.1基因表达标准化(7４.２差异基因列表(8４.３差异基因可视化(84．4差异基因聚类（95．差异表达基因功能分析(１05.1GO富集分析（105.2信号通路富集分析（1０5.３癌基因功能注释(１1６.基因结构差异分析(116.1可变剪切分析(11７.ＳNＰ分析（12７.1SＮP检测(127.2SNＰ筛选(127.３ＧO/ＫEGG富集(121.测序质量评估通过测序的数据进行进行质控,保证数据质量适合下游分析。这里我们使用fastqc和RＮA-SｅＱＣ来对数据进行质量评定。１．1测序数据过滤测序得到的原始下机数据往往有许多问题,不能直接使用,通常会经过以下过滤,尽量保证测序数据的质量。a．去除带测序接头的测序序列（rｅａds;ｂ.去除低质量的rｅads1.２质量值分布按照现有的测序技术（illuｍｉna平台单碱基的错误率应控制在1％以下，即质量值在2０以上。横坐标为reaｄｓ的碱基位置，纵坐标为单碱基质量值质量值与错误率的关系:Ｑ=-１0log10(e;其中Qphrｅｄ为测序碱基质量值，e为测phred序错误率。１.3GＣ含量分布对于RＮA测序,鉴于序列通过超声随机打断，所以理论上每个测序循环上的C、G及Ａ、T含量应分布相等,并且ＣG-cｏntent对于每个物种应大致相同。横坐标为ｒeadｓ的碱基位置，纵坐标为各种碱基的不同比例2.参考序列比对对于通过质量控制的数据，可以进行后续分析。首先需要将clｅaｎreadｓ比对到参考基因组上。由于测序时reaｄｓ是随机的,只有这些ｒｅａｄs的碱基信息和质量信息,没有其在基因组上的位置信息,比对这一步就是给所有readｓ一个在基因组上位置的信息。在ＲNA测序中，其实测的是ｃDNＡ的序列,由于内含子的存在，所以会较常出现一条read跨内含子的情况,tｏphａｔ2可以较好的处理这种情况,所以我们选用ｔophａｔ2来做比对。比对率间接反应了测序的质量和建库的质量,若比对率低,很可能建库时混入了其他物种的序列,导致无法比对到研究的物种参考基因组上。ｒeadｓ比对到基因上的位置统计：SaｍpｌeInｔｒaｇenicRaｔeEｘonicRａteIntroniｃRateInｔerｇeniｃRaｔeSｐliｔRｅadｓExpｒessiｏｎＰrofｉlｉngEｆficｉencyTｒａｎsｃｒipｔｓDeｔecteｄGｅnesDｅtected1ＢJ０.8850.7３８0．14７０.1１49,9１0，０1０0.73832，７9615,4３4（1Ｓaｍple:样本名(2InｔragｅnicRate:比对到基因内的reaｄs比例(3ExoｎicRaｔe:比对到外显子的readｓ比例（4IｎtｒonicRaｔｅ:比对到内含子的readｓ比例(5ＩnteｒｇeniｃRate:比对到基因间区的ｒｅａｄs比例(6SpｌiｔReaｄｓ：比对到两外显子交接处的reads数（7ExpresｓｉoｎProfilingEfｆiciｅｎｃy:比对到外显子上的reads占总体的比例(8ＴransｃrｉｐｔｓDｅteｃted:比对上ｒｅads数大于5的转录本数(9GｅnｅsDeteｃｔed:比对上rｅａdｓ数大于5的基因数３.基因表达水平3.1基因表达水平定量在RＮA－seq分析中,我们可以通过定位到基因组区域或基因外显子区的rｅaｄｓ的计数来估计基因的表达水平。Reads计数除了与基因的真实表达水平成正比外，还与基因的长度和测序深度成正相关。为了使不同基因、不同实验间估计的基因表达水平具有可比性,人们引入了RPＫM的概念,RPKM(ReadsPｅｒKilobasesperＭiｌliｏnreads是每百万readｓ中来自某一基因每千碱基长度的reａds数目。RPKM同时考虑了测序深度和基因长度对reads计数的影响,是目前最为常用的基因表达水平估算方法(Mortａzavｉetaｌ.,2０0８。Geｎｅ_IＤＳample１Ｓaｍple2Sａmple3Ｓampｌｅ4Ｓaｍple５Sampｌe6ENSG０0００000０0０３4９.3２4６.94４8．９1２２.５１2０.6022.95ENSG000０0000４１935.9234.5833.６932．8035.6532.73ENSG000000004571．３４0.941.192.０62.1３2.２6ENSG0０00０0004６01.191.201.２2３.003.3３3.06（1Gene_ID:En...
